【摘要】：瓊膠寡糖由瓊膠降解所得,在食品、藥品、化妝品等領(lǐng)域有重要的應(yīng)用價值。酶解法制備瓊膠寡糖具有高效、底物重復(fù)性高和環(huán)境友好等優(yōu)勢,因而獲得酶學性質(zhì)良好的瓊膠酶在瓊膠寡糖生產(chǎn)中具有重要意義。本文針對此開展研究,主要研究內(nèi)容和結(jié)果如下:(1)通過龍須菜原位富集紅樹林沉積物中瓊膠降解菌,經(jīng)16S r RNA基因多樣性驗證,富集后的結(jié)果是樣品組Mgv-B富集效果最明顯,表明在沉積物中富集得到了高豐度的多糖相關(guān)的降解菌。隨后,通過高通量測序獲得了大量來源于紅樹林沉積物中未培養(yǎng)微生物的瓊膠酶基因資源,對其中30個具有完整開放閱讀框瓊膠酶基因在大腸桿菌中進行原核表達并驗證其粗酶活性,其中21個具有瓊膠酶活性。(2)在所獲得的具有活性的瓊膠酶基因中挑選出一條氨基酸序列比對相似性最低的基因,命名為aga M1。對aga M1基因進行原核表達與純化,重組Aga M1(r Aga M1)分子量約為70 k Da,最適溫度為50°C,最適p H為7.0。r Aga M1具有良好的溫度及p H穩(wěn)定性,在50°C下保溫60 h后仍剩余36.53%的相對酶活,在p H 5.0及p H 10.0緩沖液中分別保溫60 h后仍分別剩余62.15%和55.97%的相對酶活。Ag+、Cu2+、十二烷基硫酸鈉(SDS)、Beta-巰基乙醇(Beta-Me)對酶活有明顯的抑制作用;而鹽酸胍(guanidine-HCl)、二硫蘇糖醇(DTT)對酶活有明顯的促進作用。r Aga M1的Km值為1.82 mg/ml,Vm值為357.14 U/mg,與底物親和力較大。其降解瓊脂糖終產(chǎn)物為新瓊四糖和新瓊六糖。(3)通過基因截短的方法初步探究基因缺失對瓊膠酶活性的影響。結(jié)果表明,N端截短完全破壞了瓊膠酶的活性。而C端截短的兩個蛋白r Aga M1-01(從C端截短480bp)和r Aga M1-02(從C端截短960bp)則保留了對瓊脂糖的降解活性,但酶活性均降低,且熱穩(wěn)定性、p H穩(wěn)定性、金屬離子和螯合劑的耐受性也均不如原始瓊膠酶r Aga M1。進一步的分析發(fā)現(xiàn),二者的最適溫度沒有發(fā)生改變,均為50°C,但最適p H均發(fā)生了改變,其中r Aga M1-01和r Aga M1-02分別為9.0和6.0。表明C端的480-960bp之間的序列對酶活作用p H具有重要影響。此外,r Aga M1-01降解瓊脂糖終產(chǎn)物為新瓊四糖、新瓊六糖、新瓊八糖、新瓊十糖及新瓊十二糖,r Aga M1-02降解瓊脂糖終產(chǎn)物為新瓊八糖、新瓊十糖及新瓊十二糖。這些結(jié)果初步證明截短區(qū)域(C0-C960)對瓊膠酶的活性、穩(wěn)定性、離子耐受性及底物親和力可能存在重要影響。此外,r Aga M1-01及r Aga M1-02可產(chǎn)生新瓊八糖、新瓊十糖及新瓊十二糖高聚合度的新瓊寡糖,而目前通過酶解法很難獲得高聚合度的新瓊寡糖,因而r Aga M1-01及r Aga M1-02和其產(chǎn)生的高聚合度寡糖在工業(yè)應(yīng)用中具有重要的應(yīng)用價值。
【學位授予單位】：國家海洋局第三海洋研究所
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：Q93;Q78

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前3條

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2 劉莉揚;崔鴻飛;田埂;;高通量測序技術(shù)在宏基因組學中的應(yīng)用[J];中國醫(yī)藥生物技術(shù);2013年03期

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相關(guān)碩士學位論文 前2條

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本文編號：2625641