參與秀麗隱桿線蟲對銅綠假單胞菌PA14逃避的新基因篩選和功能鑒定

發(fā)布時間：2020-04-07 12:00

【摘要】：生物體多生活于紛繁復雜的環(huán)境,如何面對復雜各異環(huán)境并做出正確有效的應答,這是其必須面對的問題。通常生物體的感覺調控對其感知、行為、應答以及生存都是非常重要的。逃避行為是機體應對有害環(huán)境重要且有效的防御機制之一。逃避行為作為一種常見的神經生物學行為模式,目前在該方向的分子機制研究報道并不全面,且已報道的相關途徑或神經元也不足以完全解釋生物體的逃避行為。故本研究以秀麗隱桿線蟲作為模型,研究病原細菌所誘發(fā)的逃避行為及其機制,這對于理解生物體如何應對復雜各異的外界環(huán)境具有重要意義。秀麗隱桿線蟲(Caenorhabditis elegans)具有通體透明,生活周期短,生理結構簡單,易于培養(yǎng),適合高通量篩選,易于遺傳操作等生物學優(yōu)勢,是目前生物學研究領域當中的重要模型之一。在其它動物模型中具有毒力的致病基因在線蟲中同樣被證明是有效的;而人類的許多細菌病原體,如銅綠假單胞菌PA14,也能有效侵染線蟲,因而秀麗隱桿線蟲也常被認為是研究微生物致病機制和宿主應答反應的一種簡便而經濟的模型宿主。WNT信號途徑中的配體是一種分泌的脂質修飾的糖蛋白,可與細胞表面受體Frizzled(Fz)結合,結合過程主要通過高度保守的絲氨酸殘基和半胱氨酸殘基發(fā)生共價連接。如果配受體結合后不產生β-catenin在細胞中累積,則被稱為非經典WNT信號途徑。非經典WNT信號途徑常參與細胞的極化,細胞內鈣離子變化等生理學過程,但是非經典WNT信號途徑是否會介導線蟲逃避的神經生物學行為卻目前尚不清楚。因此該研究以秀麗隱桿線蟲作為研究對象,利用銅綠假單胞菌PA14進行逃避實驗,采用RNAi、神經元回復表達、熒光注射、線蟲雜交等實驗手段,檢測非經典WNT信號途徑中不同基因對線蟲病原逃避行為的影響,為更好闡述逃避這種重要神經生物學行為的分子機制奠定基礎。本文研究中得到的主要結果包括:1、WNT信號途徑的配體cwn-1和受體mig-1參與了線蟲對銅綠假單胞菌(PA14)的逃避。我們的研究以秀麗隱桿線蟲作為研究對象,利用富含銅綠假單胞菌的平板來進行逃避實驗,對WNT信號途徑中配體和受體進行篩選,我們發(fā)現WNT信號途徑配體cwn-1和受體mig-1突變后的線蟲,加入到銅綠假單胞菌的小板中,其逃避指數增加,這說明WNT信號途徑配體cwn-1和受體mig-1參與了線蟲對銅綠假單胞菌的逃避。2、PLC信號途徑中plc-1、plc-3、egl-8、itr-1參與線蟲對病原細菌PA14的逃避。我們發(fā)現PLC途徑中的plc-1、plc-3、egl-8、itr-1突變后的線蟲,加入到銅綠假單胞菌的小板中,其逃避指數增加。因為PLC途徑位于非經典WNT途徑下游,這說明非經典WNT信號途徑下游PLC途徑中的plc-1、plc-3、egl-8、itr-1抑制線蟲對銅綠假單胞的逃避。與此同時我們發(fā)現,磷脂酶C家族基因plc-2是不參與線蟲對銅綠假單胞的逃避的。另外我們發(fā)現非經典WNT途徑下游的PKC途徑是不參與線蟲對銅綠假單胞的逃避的。3、WNT信號途徑和PLC信號途徑上下游關系的研究我們發(fā)現WNT信號途徑配體cwn-1和受體mig-1對PA14的逃避表型和PLC信號一致,因而我們在非經典WNT信號途徑的配體cwn-1中加入了磷脂酶c家族基因plc-1的激動劑,并統計了其逃避指數。我們發(fā)現cwn-1加過磷脂酶c家族基因plc-1的激動劑后,其逃避指數是介于cwn-1單獨突變株和單獨用磷脂酶c家族基因plc-1的激動劑處理的N2逃避指數之間。據此,我們猜測,究竟plc-1激動劑在整體動物中作用是否完全,抑或是非經典WNT途徑下游可能部分通過PLC途徑起作用或者其他途徑起作用,這有待進一步研究。4、熒光共注射實驗研究發(fā)現cwn-1表達位置在線蟲頭部神經元。通過顯微注射的方法,在線蟲體內觀察cwn-1、mig-1、egl-8啟動子驅動下mCherry紅色熒光的表達,并與線蟲株tph-1::GFP進行共定位觀察。結果發(fā)現,tph-1基因主要是在線蟲頭部神經元ADF和NSM中表達,而上述三個基因中cwn-1表達位置在頭部神經元,但無法與TPH-1共定位。本文的創(chuàng)新之處:首次確定了參與秀麗隱桿線蟲病原逃避的新基因cwn-1、mig-1、plc-1、egl-8、plc-3、itr-1。非經典WNT途徑下游可能部分通過PLC途徑起作用。
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