【摘要】：家蠶作為具有重要經(jīng)濟(jì)價(jià)值的鱗翅目昆蟲,每年受蠶病危害十分嚴(yán)重,嚴(yán)重制約了我國(guó)蠶絲產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。其中家蠶核型多角體病毒(Bombyx mori nucleopolyhedrovirus,BmNPV)所造成的家蠶血液型膿病是最常見(jiàn)的且危害最大的蠶病之一。由于傳統(tǒng)抗性育種的周期過(guò)長(zhǎng),加之抗性多與經(jīng)濟(jì)性狀成負(fù)相關(guān),因此,迫切需要通過(guò)分子育種來(lái)提高家蠶的抗病性。本研究首先在細(xì)胞水平敲除BmNPV凋亡抑制因子iap2和增殖復(fù)制相關(guān)基因orf59,檢測(cè)其對(duì)BmNPV增殖復(fù)制的影響;其次通過(guò)轉(zhuǎn)基因技術(shù)構(gòu)建了共同敲除BmNPV iap2和orf59基因的轉(zhuǎn)基因家蠶,對(duì)構(gòu)建的轉(zhuǎn)基因家蠶的基因編輯效率和脫靶效率進(jìn)行了系統(tǒng)的檢測(cè);進(jìn)而檢測(cè)了轉(zhuǎn)基因家蠶對(duì)BmNPV的抗性效果,以及對(duì)BmNPV的DNA復(fù)制和基因轉(zhuǎn)錄影響,并鑒定轉(zhuǎn)基因家蠶對(duì)個(gè)體生長(zhǎng)發(fā)育和經(jīng)濟(jì)性狀的影響;最后通過(guò)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)初步分析轉(zhuǎn)基因家蠶品系調(diào)控細(xì)胞凋亡,進(jìn)而抑制BmNPV增殖復(fù)制的作用機(jī)制。論文取得的主要結(jié)果如下:1.BmNPV iap2和orf59對(duì)BmNPV增殖的影響利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)構(gòu)建了單獨(dú)敲除BmNPV iap2和orf59的表達(dá)載體。相對(duì)定量檢測(cè)病毒不同時(shí)期基因的轉(zhuǎn)錄水平變化,發(fā)現(xiàn)敲除BmNPV iap2和orf59,病毒基因的表達(dá)量在48h都有了明顯的下調(diào)。進(jìn)一步同時(shí)敲除BmNPV iap2和orf59,熒光定量分析顯示病毒基因轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)一步下調(diào),同時(shí)對(duì)敲除BmNPV iap2之后對(duì)宿主凋亡相關(guān)基因進(jìn)行檢測(cè),發(fā)現(xiàn)caspase家族基因BmICE的表達(dá)量有明顯上調(diào),而Bcl-2家族基因BmBuffy的表達(dá)與對(duì)照相比沒(méi)有明顯變化。以上結(jié)果表明,可以通過(guò)敲除BmNPV抗凋亡基因iap2和復(fù)制相關(guān)基因orf59引起家蠶細(xì)胞凋亡通路變化,從而抑制BmNPV增殖復(fù)制,應(yīng)用于家蠶抗病育種研究。2.基因編輯BmNPV iap2和orf59的抗性素材創(chuàng)制為了進(jìn)一步分析應(yīng)用抗凋亡作用提高家蠶抗病毒作用的效率,本研究成功的構(gòu)建了轉(zhuǎn)基因注射載體piggyBac[U6-sgIAP2-U6-sgORF59-3×P3 DsRed afm],通過(guò)顯微注射技術(shù)獲得表達(dá)sgIAP2sgORF59的轉(zhuǎn)基因家蠶,與表達(dá)Cas9蛋白的轉(zhuǎn)基因家蠶雜交之后獲得獲得雙陽(yáng)性品系Cas9(+)/sgIAP2sgORF59(+)和對(duì)照品系Cas9(+)/sgIAP2sgORF59(-)、Cas9(-)/sgIAP2sgORF59(+)和Cas9(-)/sgIAP2sg ORF59(-)。通過(guò)T7E1酶切和T克隆測(cè)序檢測(cè)發(fā)現(xiàn)雙陽(yáng)性品系在添食BmNPV 12h起就能夠有效的編輯靶位點(diǎn),48h編輯效率達(dá)到100%,并持續(xù)到120h。靶基因的編輯頻率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明,從添食病毒12h開始出現(xiàn)比例較小的大片段缺失,僅有19.4%,到120h大片段缺失的比例達(dá)到62.5%。對(duì)2個(gè)靶位點(diǎn)預(yù)測(cè)的6個(gè)脫靶率最高的脫靶位點(diǎn)經(jīng)T克隆測(cè)序分析未檢測(cè)到脫靶現(xiàn)象。以上研究表明我們獲得了能夠特異性的編輯BmNPV基因組的轉(zhuǎn)基因基因編輯家蠶。3.轉(zhuǎn)基因家蠶的抗性鑒定和主要經(jīng)濟(jì)性狀分析通過(guò)對(duì)雙陽(yáng)性品系和對(duì)照品系在4齡起蠶添食不同劑量的BmNPV,鑒定這兩個(gè)家蠶品系對(duì)BmNPV的抗性水平。結(jié)果顯示,Cas9(+)/sgIAP2sgORF59(+在添食不同劑量的ODV之后相比于Cas9(-)/sgIAP2sgORF59(-)的發(fā)病時(shí)間均推遲1~2天,且最終的死亡率均高于Cas9(-)/sgIAP2sgORF59(-)。SPSS軟件進(jìn)一步分析Cas9(+)/sgIAP2sgORF59(+)家蠶的LD_(50)為2.25×10~6多角體/頭,相比對(duì)照品系Cas9(-)/sgIAP2sgORF59(-)的LD_(50)為2.46×10~4多角體/頭,其抗性提高了近100倍。通過(guò)熒光定量PCR檢測(cè)病毒DNA的拷貝數(shù),結(jié)果顯示轉(zhuǎn)基因家蠶在4齡起的添毒實(shí)驗(yàn)中,病毒DNA的拷貝數(shù)從72h起明顯低于Cas9(-)/sgIAP2sgORF59(-),在5齡起添食BmNPV后,從96h開始雙陽(yáng)性品系的DNA拷貝數(shù)受到了明顯的抑制。qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示雙陽(yáng)性品系的病毒基因ie-1、gp64、vp39、poly在4齡起蠶添食BmNPV后的轉(zhuǎn)錄水平從48h起顯著低于對(duì)照品系,5齡起蠶添食病毒后病毒基因的轉(zhuǎn)錄水平則從96h起開始明顯低于對(duì)照品系。為了分析轉(zhuǎn)基因品系個(gè)體發(fā)育和經(jīng)濟(jì)性狀是否受到了影響,本研究對(duì)獲得的4種雜交品系的幼蟲體重和全繭量、繭層量和繭層率進(jìn)行稱重統(tǒng)計(jì)分析,結(jié)果顯示均沒(méi)有明顯變化。以上結(jié)果表明,本實(shí)驗(yàn)所構(gòu)建的轉(zhuǎn)基因家蠶不僅可以提高對(duì)BmNPV的抗性,而且對(duì)其經(jīng)濟(jì)性狀沒(méi)有影響。4.轉(zhuǎn)基因家蠶的抗性差異基因分析為了探究轉(zhuǎn)基因家蠶凋亡調(diào)控的抗性機(jī)制,本研究對(duì)Cas9(+)/sgIAP2sgORF59(+)和Cas9(-)/sgIAP2sgORF59(-)品系添食BmNPV 48h后的樣品進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組分析。首先本研究對(duì)提取的樣品進(jìn)行病毒基因復(fù)制水平檢測(cè),結(jié)果顯示,在添食BmNPV 48h后,Cas9(+)/sgIAP2sgORF59(+)品系的vp39表達(dá)量顯著低于Cas9(-)/sgIAP2sgORF59(-)品系。轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果顯示,共篩選到709個(gè)差異基因,其中上調(diào)基因有194個(gè),下調(diào)基因有515個(gè)。對(duì)差異基因進(jìn)行eggNOG聚類分析,結(jié)果顯示,差異基因主要集中在能量轉(zhuǎn)運(yùn)、核糖體翻譯、翻譯與修飾這三類功能中。通過(guò)KEGG通路聚類分析差異基因,結(jié)果顯示差異基因主要集中在氧化磷酸化通路,共有41個(gè)差異基因,且全部為下調(diào)表達(dá)基因。從這41個(gè)差異基因中篩選出12個(gè)差異較大的基因進(jìn)行熒光定量檢測(cè),結(jié)果表明其在感染BmNPV 48h后轉(zhuǎn)基因家蠶的轉(zhuǎn)錄水平的確低于Cas9(-)/sgIAP2sgORF59(-),且在細(xì)胞水平的檢測(cè)結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)一致。為了鑒定敲除BmNPV iap2基因之后對(duì)家蠶細(xì)胞凋亡的影響,本研究檢測(cè)了凋亡相關(guān)基因Bmiap2、BmICE、BmBuffy的轉(zhuǎn)錄水平變化,結(jié)果發(fā)現(xiàn)Bmiap2的表達(dá)下調(diào),BmICE的轉(zhuǎn)錄水平有明顯上調(diào),而BmBuffy表達(dá)沒(méi)有明顯變化。說(shuō)明在敲除BmNPV iap2和orf59之后,主要引起宿主能量水平和凋亡相關(guān)通路的變化。
【圖文】：

西南大學(xué)碩士學(xué)位論文作，可以調(diào)節(jié) caspase 之間的相互作用和酶的失活，，以及與一些解離 IAP-casp合物因子間的相互作用；并且在突變 BmNPV 的 iap2 基因后，病毒的增殖復(fù)受到了明顯的抑制。雖然病毒的抗凋亡基因已經(jīng)被報(bào)道可以參與調(diào)控宿主的途徑，但是具體的調(diào)控機(jī)制目前還尚不清楚[64-66]。

2017）等通過(guò)干擾病毒囊膜蛋白GP64的受體BmREEP和對(duì) BmNPV 的感性[81, 82]。R/Cas9 技術(shù)進(jìn)展R/Cas9 研究進(jìn)展/Cas9 是細(xì)菌和古細(xì)菌在長(zhǎng)期的進(jìn)化過(guò)程中產(chǎn)生的用來(lái)種防御機(jī)制。1988 年，Ishino 等發(fā)現(xiàn)了大腸桿菌中有一發(fā)現(xiàn)這種重復(fù)序列廣泛的存在于細(xì)菌和古細(xì)菌中[83]。20異性序列的特點(diǎn)，將其正式命名為成簇規(guī)律間隔短回Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats，CRISPR因[84]。2009 年，Marraffini 首先證明了 CRISPR 和 Cas 可以]。隨著科學(xué)家們對(duì) CRISPR/Cas 的研究加深，最終在cus pyogenes）中發(fā)現(xiàn)了 II 型 CRISPR/Cas 免疫系統(tǒng) CRIS。
【學(xué)位授予單位】：西南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：S881.2;Q78

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2616128