【摘要】：玉米是用于糧食、飼料和生物燃料的重要作物,提高產(chǎn)量和生物量在玉米研究中有重要的意義。由于玉米雜種優(yōu)勢明顯,而雄性不育是植物生殖生長過程中的一種常見表型,在玉米雜種優(yōu)勢利用上具有重要的應(yīng)用價值,因此長期以來受到遺傳育種工作者的廣泛重視。另外,植物生長發(fā)育中營養(yǎng)生長是生殖生長的先決條件。植物營養(yǎng)生長可以分為幼年期(juvenile stage)和成年期(adult stage)兩個階段,由幼年期營養(yǎng)生長到成年期營養(yǎng)生長過渡的過程稱為營養(yǎng)生長時相轉(zhuǎn)變(vegetative phaseegetative phase change)。營養(yǎng)生長時相轉(zhuǎn)換是一個復(fù)雜的過程,可能受到多個基因的調(diào)控,對后期的生殖生長時相轉(zhuǎn)變(reproductive phase change)有重要的影響,在玉米生產(chǎn)上具有一定的指導(dǎo)意義。本論文的研究工作包含兩個部分,一是關(guān)于玉米雄性不育基因ms39的精細定位,二是關(guān)于兩個玉米營養(yǎng)生長時相轉(zhuǎn)換相關(guān)基因的遺傳轉(zhuǎn)化。前期實驗室通過太空誘變得到一份玉米雄性不育突變體,命名為ms39。本研究主要是對ms39進行精細定位及相關(guān)研究。首先對突變體的表型進行鑒定及花藥進行細胞學(xué)觀察。利用(ms39×Mo17)F_2群體1073株不育植株作為定位群體,通過不斷尋找和開發(fā)新的分子標記對ms39進行精細定位,對定位區(qū)間內(nèi)的12個候選基因進行克隆測序及序列比對分析,根據(jù)候選基因序列中的差異位點設(shè)計基因內(nèi)分子標記驗證定位結(jié)果。主要結(jié)果如下:(1)利用統(tǒng)計分析方法,進一步分析了不同育性分離群體中可育植株和不育株的株高、穗位高、雄穗分枝數(shù)、穗長、莖粗等性狀差異,發(fā)現(xiàn)不育植株均顯著低于可育株。(2)通過石蠟切片技術(shù)對小孢子發(fā)育過程進行細胞學(xué)觀察,發(fā)現(xiàn)ms39突變體花藥發(fā)育異常主要是從減數(shù)分裂二分體時期開始,二分體開始自溶,絨氈層細胞排列不規(guī)則,最終導(dǎo)致四分體不能形成小孢子。(3)通過不斷開發(fā)新的分子標記,利用(ms39×Mo17)F_2的群體1073株不育株進行精細定位,最終將ms39定位在標記L7和M30之間,兩者物理距離為365kb。在365kb的定位區(qū)間內(nèi),開發(fā)了兩個基因內(nèi)分子標記ARF12-3-2和NACTF82,最終將ms39基因定位在L7和NACTF82之間,物理距離為319kb。(4)在標記L7和NACTF82之間,預(yù)測10個候選基因,克隆測序分析10個基因的CDS區(qū)序列。結(jié)果表明:不育突變體中Zm00001d043909Cals12基因在編碼區(qū)存在4個堿基的缺失。(5)根據(jù)候選基因Zm00001d043909Cals12在不育植株和可育株間的序列差異位點,設(shè)計引物InDel-cals,分別對(ms39×B73)BC_2F_2群體中117株不育單株,(ms39×Mo17)BC_4F_2群體320株不育單株,(ms39×Mo17)BC5F2群體中340株不育單株及姊妹交群體中170株不育單株進行分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn)InDel-cals標記均未檢測到交換單株,說明在以上供試群體中Zm00001d043909Cals12基因與ms39表現(xiàn)為完全連鎖。(6)相對于正�？捎�,突變體ms39在候選基因Zm00001d043909Cals12的編碼區(qū)有4個堿基的缺失,利用DNAman軟件預(yù)測其編碼蛋白序列,結(jié)果表明4個堿基的缺失會導(dǎo)致Cals12基因翻譯蛋白提前終止,使Cals12蛋白功能異常。前期通過生物信息學(xué)分析得到了兩個可能控制玉米營養(yǎng)生長時相轉(zhuǎn)換的基因ZmNF-YA-10(Nuclear factor,具有CCAAT位點)和一個未注釋的基因ZmNovel-TF。為了了解這兩個基因的功能,分別構(gòu)建了2個基因的干涉載體pANIC8D-ZmNF-YA-10-RNAi、pANIC8D-ZmNovel-TF-RNAi。通過農(nóng)桿菌介導(dǎo),轉(zhuǎn)入玉米Hi-II幼胚中。比較后代轉(zhuǎn)基因植株和非轉(zhuǎn)基因植株最后具有蠟質(zhì)層的葉片(last leaf with epicuticular wax,LLEW)和總?cè)~片數(shù)之間差異。主要結(jié)果如下:(1)經(jīng)統(tǒng)計分析,轉(zhuǎn)pANIC8D-ZmNF-YA-10-RNAi植株的T1代LLEW、葉片總數(shù)均顯著高于非轉(zhuǎn)基因植株(7.63±0.49 VS 7.29±0.25,P0.05,15.28±1.41 VS14.67±0.21,P0.05)。溫室種植T2代的轉(zhuǎn)基因植株的LLEW平均值顯著高于非轉(zhuǎn)基因植株(6.91±0.0015 VS 6.61±0.007,P(0.05)。上述結(jié)果表明,轉(zhuǎn)pANIC8D-ZmNF-YA-10-RNAi植株一定程度上延長了玉米營養(yǎng)生長時相轉(zhuǎn)換的時間。(2)比較T1代ZmNovel-TF-RNAi的轉(zhuǎn)基因植株和非基因植株的LLEW、葉片總數(shù)等性狀。結(jié)果表明轉(zhuǎn)基因植株的LLEW和葉片總數(shù)與非轉(zhuǎn)基因的LLEW、葉片總數(shù)均無顯著差異。溫室種植T2代的轉(zhuǎn)基因植株LLEW與非轉(zhuǎn)基因的LLEW同樣無顯著差異。綜上所述,本研究將ms39基因定位在分子標記L7和NACTF82之間,兩者相距319kb。基于候選基因的克隆測序和序列比對分析,推測Cals12可能是ms39關(guān)鍵候選基因,為下一步克隆該基因奠定了基礎(chǔ)。Cals12是一個編碼胼胝質(zhì)合成酶基因,胼胝質(zhì)在花藥發(fā)育中扮演著重要角色。所以,ms39不育基因的研究豐富了玉米雄性不育資源及調(diào)控代謝途徑。利用RNAi技術(shù),發(fā)現(xiàn)干涉ZmNF-YA-10基因,LLEW的平均值在轉(zhuǎn)基因植株和非轉(zhuǎn)基因植株中差異顯著,說明ZmNF-YA-10基因可能與玉米營養(yǎng)生長轉(zhuǎn)換有關(guān)。干涉ZmNovel-TF基因,在轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因植株后代中LLEW平均值無顯著差異。
【圖文】：

擬南芥花藥發(fā)育過程(Ma2005)Fig.1-1AntherdevelopmentprocessinArabidopisis(Ma2005)

四川農(nóng)業(yè)大學(xué)博士學(xué)位論文5胞分化明顯，性母細胞進入第一次減數(shù)分裂晚前期。圖1-3-B是花藥單個小室的橫切面，相當于圖1-3-A中長度為250μm的花藥，圖1-3-C相當于圖1-3-A中700μm的花藥；圖1-3-D四層體細胞包圍了中央性母細胞（減數(shù)分裂前），絨氈層細胞核以單核形式存在；圖1-3-E絨氈層細胞變成雙核，中層細胞開始降解，性母細胞處于終變期，胼胝質(zhì)在小孢子囊中心積累，圖1-3-F，花粉母細胞減數(shù)分裂形成四分體；圖1-3-G，中層細胞（ML）和絨氈層開始降解(Timofejeva et al. 2013)。圖1-3玉米自交系B73花藥發(fā)育過程(Timofejeva et al. 2013)Fig. 1-3Anther development process of maize inbred line B73 (Timofejeva et al. 2013)L1-d:表皮（紅色）；L2-d：L2細胞（黃色）；EN:內(nèi)層；ML:中層；TA：絨氈層；AR:孢原細胞；Me：性母細胞；SPC：次生壁細胞L1-d: epidermis (red); L2-d: L2-d cells (yellow); EN: endothecium; ML: middle layer; TA: tapetal layer;AR: archesporial cell; Me: meiocytes; SPC: secondary parietal cells.Ma等人研究玉米花藥長度和時期有一定的關(guān)系(Ma et al. 2008)
【學(xué)位授予單位】：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：S513

【相似文獻】

相關(guān)博士學(xué)位論文 前1條

1 朱永卉;玉米雄性不育基因ms39精細定位及生長發(fā)育相關(guān)基因的遺傳轉(zhuǎn)化[D];四川農(nóng)業(yè)大學(xué);2018年

，

本文編號：2612772