【摘要】：稻曲病菌(Ustilaginoidea virens)引起的稻曲病是危害水稻生產(chǎn)的重要病害,其產(chǎn)生的稻曲毒素也極大地威脅糧食安全。本研究在組織學(xué)水平對(duì)稻曲菌在抗、感品種上的侵染差異進(jìn)行了觀察,研究了稻曲病菌的侵入時(shí)期及其侵染過(guò)程,利用ATMT方法構(gòu)建了高效的稻曲病菌突變體庫(kù),從中篩選出產(chǎn)孢相關(guān)突變體,并對(duì)產(chǎn)孢相關(guān)基因UvPRO1進(jìn)行了功能分析。研究的主要結(jié)果如下:1.用GFP熒光標(biāo)記的稻曲菌分生孢子分別在孕穗期(幼穗分化7-8期)接種抗病品種IR28和感病品種晚秈98,在體式熒光顯微鏡和激光共聚焦顯微鏡下觀察稻曲菌在兩個(gè)品種穗部的侵染過(guò)程。結(jié)果表明,接種后6、12、24、48和72 h,分生孢子在抗、感病品種穎殼表面的萌發(fā)率分別為11.4%、38.1%、42.5%、56.7%、57.2%和12.7%、36.5%、46.3%、73.4%、75.7%,在接種48 h后稻曲菌在抗病品種穎殼上的萌發(fā)率顯著低于感病品種。接種感病品種后3-15 d,菌絲首先在穎殼外表面延伸擴(kuò)展,隨后通過(guò)穎殼內(nèi)外稃之間的縫隙擴(kuò)展至穎殼內(nèi)側(cè),并在雄蕊和雌蕊表面定殖,逐步侵染花絲、花藥、花柱和柱頭,并將整個(gè)花器包裹在致密的菌絲內(nèi),菌絲團(tuán)進(jìn)一步膨大,從內(nèi)外稃之間擠出,形成稻曲球。而在抗病品種上,稻曲菌的侵染過(guò)程與感病品種基本一致,但稻曲菌菌絲侵入到抗病品種穎殼內(nèi)側(cè)的比例比感病品種下降了86.9%-92.3%,菌絲侵染抗病品種穎花花柱和柱頭的時(shí)間均比感病品種推遲了3d,并且對(duì)花柱和柱頭的侵染比例下降了92.2%-95.3%和92.5%-95.7%。在接種15 d后,抗病品種和感病品種的穗發(fā)病率分別為7.5%和89.1%,每穗病粒數(shù)分別為4.6和31.7。上述結(jié)果表明抗性品種穎殼表面分生孢子的萌發(fā)及菌絲從穎殼外表面侵入穎殼內(nèi)側(cè)受到抑制,推遲了菌絲侵染花器的時(shí)間和侵染比例,減少了在水稻授粉前侵染穎花的幾率,導(dǎo)致穗發(fā)病率和病粒數(shù)顯著降低。2.選用GFP熒光標(biāo)記的稻曲菌分生孢子分別接種芽期、分蘗期、孕穗期和揚(yáng)花期的水稻植株,觀察接種后的侵染過(guò)程,并利用GFP引物檢測(cè)接種后不同生育期植株不同組織的帶菌率。研究結(jié)果表明:(1)芽期浸根接種后1-3d,稻曲菌分生孢子能附著在胚根和根毛的表面萌發(fā)形成菌絲,從根毛基部或側(cè)根生長(zhǎng)點(diǎn)的細(xì)胞間隙侵入胚根表皮。接種5d后,菌絲在側(cè)根生長(zhǎng)點(diǎn)和胚根表皮組織內(nèi)大量繁殖擴(kuò)展,并向上擴(kuò)展至胚芽鞘。接種7d后,在芽鞘和不完全葉表面有少量菌絲定殖。在接種后30d(水稻生長(zhǎng)至分蘗期)和接種后90d(水稻生長(zhǎng)至孕穗期)的極少數(shù)稻株的葉鞘表面觀察到有綠色熒光菌絲的存在。用PCR方法在接種后分蘗期至蠟熟期水稻植株的根、莖、葉以及孕穗期至蠟熟期的稻穗上均檢測(cè)到稻曲菌的存在。(2)分蘗期注射接種后1-7 d,附著在葉鞘和莖表面的分生孢子萌發(fā)形成菌絲,并向四周擴(kuò)展繁殖。但用PCR的方法,在孕穗期至蠟熟期的穗、葉和莖中均未檢測(cè)到稻曲菌的存在。(3)孕穗期噴霧接種后1-3 d,分生孢子萌發(fā)形成的菌絲在劍葉的葉鞘表面擴(kuò)展繁殖,形成菌絲團(tuán)。接種后5-12 d,在穎花穎殼上、雄蕊和雌蕊表面均未觀察到稻曲菌存在。但用PCR的方法在揚(yáng)花期和蠟熟期的穗和葉部檢測(cè)到稻曲菌的存在。而孕穗期注射接種后5-12 d,菌絲能通過(guò)內(nèi)外稃之間的縫隙侵入穎殼內(nèi)表面,侵染花絲、花藥、柱頭和花柱,最終形成稻曲球,發(fā)病率為93.3%,平均每穗31.4個(gè)稻曲球。用PCR方法在揚(yáng)花期和蠟熟期的穗、葉和莖部均檢測(cè)到稻曲菌的存在。用Real-time PCR方法檢測(cè)了孕穗期注射接種15 d后三種灌漿相關(guān)基因(OsPromln2、OsRISBZ1和OsGlutln1)在穎花中的相對(duì)表達(dá)量,三種灌漿相關(guān)基因在被侵染形成稻曲球的穎花中的相對(duì)表達(dá)量比被侵染未形成稻曲球的穎花分別上調(diào)13.2倍、43.5倍和28.6倍,表明灌漿基因的激活表達(dá)可能是稻曲球形成的關(guān)鍵因子。(4)揚(yáng)花期噴霧接種后1-12 d,分生孢子在穎殼外表面萌發(fā)形成的菌絲,菌絲擴(kuò)展至穎殼內(nèi)表面和子房基部,但未觀察到菌絲侵染花絲、花藥、柱頭、花柱和子房,而用PCR的方法在蠟熟期的穗部檢測(cè)到病原菌的存在。上述研究結(jié)果表明:稻曲病菌分生孢子能夠在根、莖、葉、穎花等植物組織上萌發(fā)產(chǎn)生菌絲,并向四周擴(kuò)展繁殖,但不同接種方法觀察到菌絲擴(kuò)展距離不一致。除分蘗期接種外,都可以用PCR方法在接種植株生育后期的不同組織檢測(cè)到稻曲菌存在。芽期接種后,稻曲菌侵染胚根,并可擴(kuò)展到胚芽鞘、芽鞘、不完全葉乃至地上部的葉鞘。孕穗期注射接種后,觀察到稻曲菌從侵染到稻曲球形成的直接證據(jù),表明稻曲球的形成與稻曲病菌能否在穎花受精之前完成對(duì)花柱和柱頭的侵染密切相關(guān)。一旦穎花受精完成,病原菌即使擴(kuò)展至穎花內(nèi)部,因無(wú)法吸收營(yíng)養(yǎng),也不能形成稻曲球,稻曲菌不能引起揚(yáng)花期穎花發(fā)病。3.建立了高效的農(nóng)桿菌介導(dǎo)的稻曲病菌的轉(zhuǎn)化體系。該體系中稻曲菌孢子濃度為10~5個(gè)孢子/m L,共培養(yǎng)溫度為24℃,共培養(yǎng)時(shí)間為4 d,AS濃度為200μmol/L,轉(zhuǎn)化子篩選的潮霉素濃度為200μg/mL,轉(zhuǎn)化效率為232.5個(gè)轉(zhuǎn)化子/10~5個(gè)孢子。通過(guò)該體系獲得了3016個(gè)具有穩(wěn)定潮霉素抗性的轉(zhuǎn)化子,篩選到5個(gè)產(chǎn)孢相關(guān)的突變體T-133、T-420、T-896、T-1296、T2328,采用Inverse-PCR和Tail-PCR的方法擴(kuò)增并對(duì)T-DNA側(cè)翼序列進(jìn)行了分析,結(jié)果表明突變體T-420和T-1296的T-DNA插入破壞的基因均與真菌中的假定蛋白有較低的同源性,其功能尚未見(jiàn)報(bào)道。突變體T-133的T-DNA插入破壞的基因與綠僵菌中的轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白PRO1同源。突變體T-896的T-DNA插入破壞的基因與綠僵菌中絲氨酸/蘇氨酸蛋白磷酸酶同源。突變體T-2328的T-DNA插入破壞的基因與鐮刀菌中多糖合成酶同源。4.對(duì)T-133突變體的產(chǎn)孢相關(guān)基因UvPRO1的功能進(jìn)行了分析,結(jié)果表明,在PSA平板上生長(zhǎng)6 d后,敲除轉(zhuǎn)化子ΔUvPRO1-27的菌絲生長(zhǎng)平均速度為2.20 mm/d,顯著低于互補(bǔ)轉(zhuǎn)化子CΔUvPRO1-27(2.76 mm/d)和野生型菌株(2.73 mm/d);在PS液體培養(yǎng)基中,野生型菌株和互補(bǔ)轉(zhuǎn)化子在培養(yǎng)7 d后產(chǎn)生大量分生孢子,分生孢子量分別為6.72×10~6個(gè)/mL和6.82×10~6個(gè)/mL,而敲除轉(zhuǎn)化子ΔUvPRO1-27未觀察到有分生孢子形成;在抗逆性方面,分別用不同濃度的NaCl(0.1-0.5 mol/L)、SDS(0.01-0.05%)和CR(30-70μg/m L)測(cè)定了鹽脅迫壓力、細(xì)胞膜和細(xì)胞壁壓力對(duì)敲除轉(zhuǎn)化子的影響,結(jié)果表明敲除轉(zhuǎn)化子ΔUvPRO1-27在各種壓力條件下,均表現(xiàn)出比野生型菌株和互補(bǔ)轉(zhuǎn)化子更高的敏感性;孕穗期(幼穗分化7-8期)注射接種后1-3 d,敲除轉(zhuǎn)化子ΔUvPRO1-27菌絲在水稻穎殼外表面延伸擴(kuò)展。接種4 d后,在穎殼外表面的菌絲擴(kuò)展受到抑制,直至接種12 d后,仍然未觀察到菌絲擴(kuò)展至穎花內(nèi)側(cè),在穎殼內(nèi)表面、雄蕊和雌蕊上均未觀察到有病菌存在。而野生型菌株和互補(bǔ)轉(zhuǎn)化子接種后,菌絲能夠從穎殼外表面擴(kuò)展至穎殼內(nèi)表面,侵染穎花花器并形成稻曲球。上述結(jié)果表明,UvPRO1基因?qū)Φ厩z生長(zhǎng)、產(chǎn)孢、抗逆性和致病力方面都具有顯著的調(diào)控作用。
【圖文】：

圖 1-1 稻曲病在稻穗上的發(fā)病癥狀ase symptoms of rice false smut on panicles by Ustil生及危害878 年首次由 Cooke 等在印度發(fā)現(xiàn)并報(bào)道（T亞洲、非洲、南美洲的 40 多個(gè)國(guó)家和地區(qū)的水

5稻曲菌的無(wú)性態(tài)主要以厚垣孢子和分生孢子兩種形態(tài)存在。厚垣孢子側(cè)生于菌絲上，其外壁薄而內(nèi)壁厚，多呈圓球形。黃色厚垣孢子表面具有疣狀突起（圖1-4B、D），胞內(nèi)基質(zhì)均勻，細(xì)胞器組成完整。黑色厚垣孢子周圍有明顯的刺狀突起（圖1-4A、C），胞內(nèi)基質(zhì)濃縮，幾乎沒(méi)有完整的細(xì)胞器（燕瑋婷等 2010；王疏等 1998）。厚垣孢子萌發(fā)后產(chǎn)生短小、單生或分枝、有分隔的菌絲狀分生孢子梗，梗端著生數(shù)個(gè)卵圓形或橢圓形的分生孢子（李陽(yáng)等 2008）。分生孢子薄壁、單核無(wú)色、表面光滑，其形狀呈卵圓形。分生孢子萌發(fā)后，從一端或多端伸出芽管，從芽管頂端形成次生分生孢子或三生分生孢子（張君成等 2003b）。圖1-4 掃描電鏡觀察稻曲球上的厚垣孢子形態(tài)（燕瑋婷等 2010）A和C，稻曲球上黑色厚垣孢子；B和D，，稻曲球上黃色厚垣孢子。Fig. 1-4 The surface morphology of chlamydospores of U. virensA and C, Black chlamydospores; B and D, Yellow chlamydospores.2.1.2 生理稻曲菌菌絲生長(zhǎng)最適溫度為28℃，低于13℃或高于35℃時(shí)生長(zhǎng)速度明顯減慢。菌絲生長(zhǎng)最適pH值為5-7
【學(xué)位授予單位】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：S435.111.4

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2606374