【摘要】：目的:通過體外分析hDPCs-PRF復(fù)合體的三維結(jié)構(gòu)及hDPCs-PRF復(fù)合體中hDPCs的遷移及成牙本質(zhì)向分化的能力,探索h DPCs-PRF復(fù)合體中hDPCs的生物學(xué)行為,評估hDPCs-PRF復(fù)合體作為牙髓組織再生支架的可行性。方法:1實驗一:采用組織塊法分離培養(yǎng)hDPCs,免疫組織化學(xué)染色法檢測波形絲蛋白、角蛋白的表達。Choukroun一步離心法制備PRF,于離心前迅速加入0.5ml,1×10~5個/ml hDPCs重懸液,之后離心完成hDPCs-PRF復(fù)合體的制作。將復(fù)合體分離出來后放入10%培養(yǎng)液中培養(yǎng),每3天更換一次液,并于培養(yǎng)的第7天、14天、21天行HE,免疫組織化學(xué)觀察及掃描電鏡觀察;2實驗二:h DPCs-PRF復(fù)合體的制備同實驗一。PRF的制備:采集5ml血后加入0.5ml的PBS進行2700rpm/min,離心12min。將離心后的復(fù)合體及PRF棄去下層紅細胞,只保留白膜層以上10cm作為研究對象。實驗分為三組,hDPCs-PRF復(fù)合體組,PRF+細胞組及單純細胞培養(yǎng)組。hDPCs-PRF復(fù)合體組的人牙髓細胞嵌入在PRF的白膜層中生長增殖,PRF+細胞組的人牙髓細胞游離于PRF外,單純細胞培養(yǎng)組人牙髓細胞單獨培養(yǎng)。以上三組在加入有4ml 10%礦化液的六孔板中培養(yǎng),每三天換一次液。于7d,14d收集樣本行RT-PCR檢測人牙髓細胞ALP、DSPP、COL-I mRNA的表達水平。結(jié)果:1經(jīng)組織塊法培養(yǎng)的牙髓細胞,形態(tài)單一,呈長梭形。免疫組化染色顯示波形絲蛋白呈陽性,角蛋白呈陰性,提示該細胞為間充質(zhì)來源。2 h DPCs-PRF復(fù)合體宏觀上與PRF相似,主要由黃色纖維蛋白和末端紅細胞構(gòu)成,中間為富含白細胞的白膜層。SEM可觀察到復(fù)合體中的處于皺縮狀態(tài)的hDPCs以及各種白細胞,紅細胞。顯微鏡下觀察,hDPCs-PRF復(fù)合體是由柔軟、致密聚合的纖維蛋白鏈組成的三維結(jié)構(gòu)。紅色部分主要是正常形狀的紅細胞夾帶一些未成熟的纖維蛋白;中間的白膜層中可以看到密集核藍染的白細胞及血小板,形狀不規(guī)則且體積比白細胞大的細胞;波形蛋白及角蛋白染色結(jié)果顯示體積較大的細胞波形蛋白染色陽性,角蛋白染色陰性,提示為制備復(fù)合體時加入的hDPCs。培養(yǎng)的第7d、14d、21天觀察發(fā)現(xiàn)隨著培養(yǎng)時間的推移,白膜層逐漸地溶解消失,白細胞及hDPCs隨白膜層的消失,逐漸消失或沿著復(fù)合體邊緣游走。3 RT-PCR結(jié)果顯示在礦化誘導(dǎo)第7天,復(fù)合體組中ALP及COL-I、mRNA表達都比對照組和(PRF+細胞)組高;第14天復(fù)合體組中時DSPP及COL-I mRNA表達都比對照組高,差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)論:1將人牙髓細胞嵌入PRF中制備成hDPCs-PRF復(fù)合體,復(fù)合體可緩慢釋放復(fù)合體內(nèi)的牙髓細胞到培養(yǎng)基中。2 hDPCs-PRF復(fù)合體為其內(nèi)的人牙髓細胞提供良好的生長和分化的環(huán)境,在礦化誘導(dǎo)的培養(yǎng)條件下,復(fù)合體內(nèi)的人牙髓細胞成骨/牙本質(zhì)標記基因的表達增強,提示hDPCs-PRF復(fù)合體更有利于促進牙髓組織的再生。
【圖文】：

圖 1-1 hDPCs 的培養(yǎng)與鑒定染色Figure1-1 culture and identify of hDPCsA :接種后 7 天組織塊周圍有梭形或多角形細胞爬出，呈放射狀（×40 倍）B :第三代 hDPCs 形態(tài)均一，呈長梭形，平行排列或呈漩渦狀生長（×40 倍）C :hDPCs 角蛋白免疫組化染色陰性（×100 倍）D :hDPCs 波形蛋白免疫組化染色陽性（×100 倍）3.2 hDPCs-PRF 復(fù)合體3.2.1 大體觀察結(jié)果離 心 后 的 血 液 分 為 3 層 ， 上 層 為 少 量 貧 血 小 板 血 漿（platelet-poor-plasma,ppp)（圖 1-2A1），中間層為復(fù)合體(圖 1-2A2)，下層為紅細胞(圖 1-2A3)。分離出的復(fù)合體肉眼觀可以分為三部分，上面為黃色的纖維蛋白基質(zhì)（fibrin matrix)（圖 1-2 B4）以及下端的紅細胞（RBC）（圖1-2 B6），在這兩個部分之間有一層白色區(qū)域為白膜層（buffy coat）（圖 1-2

圖 1-2 hDPCs-PRF 復(fù)合體Figure 1-2 hDPCs-PRF complexA :1 為貧血小板血漿（ppp），2 為 PRF 凝膠，3 為紅細胞B :PRF 凝膠由以下組成：4 為纖維蛋白基質(zhì)，5 為白膜層，6 為紅細胞3.2.2 hDPCs-PRF 復(fù)合體掃描電鏡觀察掃描電鏡觀察結(jié)果SEM 顯示凝塊纖維蛋白呈條索狀，廣泛的聚集和凝結(jié)而形成的簇，聚集形成了堅實而厚實的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。部分呈團狀，這是由致的纖維收縮。牙髓細胞皺縮成不規(guī)則圓形，鑲嵌在纖維網(wǎng)絡(luò)中維蛋白鏈分布圖 1-7 示 4。紅細胞形狀正常，，呈雙凹圓盤狀；白細球形結(jié)構(gòu)，不規(guī)則表面。
【學(xué)位授予單位】：廣西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R781

【參考文獻】

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本文編號：2602187