發(fā)布時間：2020-03-27 00:36

【摘要】：目的:通過體外分析hDPCs-PRF復(fù)合體的三維結(jié)構(gòu)及hDPCs-PRF復(fù)合體中hDPCs的遷移及成牙本質(zhì)向分化的能力,探索h DPCs-PRF復(fù)合體中hDPCs的生物學(xué)行為,評估hDPCs-PRF復(fù)合體作為牙髓組織再生支架的可行性。方法:1實(shí)驗(yàn)一:采用組織塊法分離培養(yǎng)hDPCs,免疫組織化學(xué)染色法檢測波形絲蛋白、角蛋白的表達(dá)。Choukroun一步離心法制備PRF,于離心前迅速加入0.5ml,1×10~5個/ml hDPCs重懸液,之后離心完成hDPCs-PRF復(fù)合體的制作。將復(fù)合體分離出來后放入10%培養(yǎng)液中培養(yǎng),每3天更換一次液,并于培養(yǎng)的第7天、14天、21天行HE,免疫組織化學(xué)觀察及掃描電鏡觀察;2實(shí)驗(yàn)二:h DPCs-PRF復(fù)合體的制備同實(shí)驗(yàn)一。PRF的制備:采集5ml血后加入0.5ml的PBS進(jìn)行2700rpm/min,離心12min。將離心后的復(fù)合體及PRF棄去下層紅細(xì)胞,只保留白膜層以上10cm作為研究對象。實(shí)驗(yàn)分為三組,hDPCs-PRF復(fù)合體組,PRF+細(xì)胞組及單純細(xì)胞培養(yǎng)組。hDPCs-PRF復(fù)合體組的人牙髓細(xì)胞嵌入在PRF的白膜層中生長增殖,PRF+細(xì)胞組的人牙髓細(xì)胞游離于PRF外,單純細(xì)胞培養(yǎng)組人牙髓細(xì)胞單獨(dú)培養(yǎng)。以上三組在加入有4ml 10%礦化液的六孔板中培養(yǎng),每三天換一次液。于7d,14d收集樣本行RT-PCR檢測人牙髓細(xì)胞ALP、DSPP、COL-I mRNA的表達(dá)水平。結(jié)果:1經(jīng)組織塊法培養(yǎng)的牙髓細(xì)胞,形態(tài)單一,呈長梭形。免疫組化染色顯示波形絲蛋白呈陽性,角蛋白呈陰性,提示該細(xì)胞為間充質(zhì)來源。2 h DPCs-PRF復(fù)合體宏觀上與PRF相似,主要由黃色纖維蛋白和末端紅細(xì)胞構(gòu)成,中間為富含白細(xì)胞的白膜層。SEM可觀察到復(fù)合體中的處于皺縮狀態(tài)的hDPCs以及各種白細(xì)胞,紅細(xì)胞。顯微鏡下觀察,hDPCs-PRF復(fù)合體是由柔軟、致密聚合的纖維蛋白鏈組成的三維結(jié)構(gòu)。紅色部分主要是正常形狀的紅細(xì)胞夾帶一些未成熟的纖維蛋白;中間的白膜層中可以看到密集核藍(lán)染的白細(xì)胞及血小板,形狀不規(guī)則且體積比白細(xì)胞大的細(xì)胞;波形蛋白及角蛋白染色結(jié)果顯示體積較大的細(xì)胞波形蛋白染色陽性,角蛋白染色陰性,提示為制備復(fù)合體時加入的hDPCs。培養(yǎng)的第7d、14d、21天觀察發(fā)現(xiàn)隨著培養(yǎng)時間的推移,白膜層逐漸地溶解消失,白細(xì)胞及hDPCs隨白膜層的消失,逐漸消失或沿著復(fù)合體邊緣游走。3 RT-PCR結(jié)果顯示在礦化誘導(dǎo)第7天,復(fù)合體組中ALP及COL-I、mRNA表達(dá)都比對照組和(PRF+細(xì)胞)組高;第14天復(fù)合體組中時DSPP及COL-I mRNA表達(dá)都比對照組高,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論:1將人牙髓細(xì)胞嵌入PRF中制備成hDPCs-PRF復(fù)合體,復(fù)合體可緩慢釋放復(fù)合體內(nèi)的牙髓細(xì)胞到培養(yǎng)基中。2 hDPCs-PRF復(fù)合體為其內(nèi)的人牙髓細(xì)胞提供良好的生長和分化的環(huán)境,在礦化誘導(dǎo)的培養(yǎng)條件下,復(fù)合體內(nèi)的人牙髓細(xì)胞成骨/牙本質(zhì)標(biāo)記基因的表達(dá)增強(qiáng),提示hDPCs-PRF復(fù)合體更有利于促進(jìn)牙髓組織的再生。
【圖文】：

圖 1-1 hDPCs 的培養(yǎng)與鑒定染色Figure1-1 culture and identify of hDPCsA :接種后 7 天組織塊周圍有梭形或多角形細(xì)胞爬出，呈放射狀（×40 倍）B :第三代 hDPCs 形態(tài)均一，呈長梭形，平行排列或呈漩渦狀生長（×40 倍）C :hDPCs 角蛋白免疫組化染色陰性（×100 倍）D :hDPCs 波形蛋白免疫組化染色陽性（×100 倍）3.2 hDPCs-PRF 復(fù)合體3.2.1 大體觀察結(jié)果離 心 后 的 血 液 分 為 3 層 ， 上 層 為 少 量 貧 血 小 板 血 漿（platelet-poor-plasma,ppp)（圖 1-2A1），中間層為復(fù)合體(圖 1-2A2)，下層為紅細(xì)胞(圖 1-2A3)。分離出的復(fù)合體肉眼觀可以分為三部分，上面為黃色的纖維蛋白基質(zhì)（fibrin matrix)（圖 1-2 B4）以及下端的紅細(xì)胞（RBC）（圖1-2 B6），在這兩個部分之間有一層白色區(qū)域?yàn)榘啄樱╞uffy coat）（圖 1-2

圖 1-2 hDPCs-PRF 復(fù)合體Figure 1-2 hDPCs-PRF complexA :1 為貧血小板血漿（ppp），2 為 PRF 凝膠，3 為紅細(xì)胞B :PRF 凝膠由以下組成：4 為纖維蛋白基質(zhì)，5 為白膜層，6 為紅細(xì)胞3.2.2 hDPCs-PRF 復(fù)合體掃描電鏡觀察掃描電鏡觀察結(jié)果SEM 顯示凝塊纖維蛋白呈條索狀，廣泛的聚集和凝結(jié)而形成的簇，聚集形成了堅(jiān)實(shí)而厚實(shí)的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。部分呈團(tuán)狀，這是由致的纖維收縮。牙髓細(xì)胞皺縮成不規(guī)則圓形，鑲嵌在纖維網(wǎng)絡(luò)中維蛋白鏈分布圖 1-7 示 4。紅細(xì)胞形狀正常，，呈雙凹圓盤狀；白細(xì)球形結(jié)構(gòu)，不規(guī)則表面。
【學(xué)位授予單位】：廣西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R781

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前7條

1 楊世茂;王明國;李靜;劉金盼;林夏蓮;徐煒;;富血小板纖維蛋白與富血小板血漿體外釋放生長因子的比較及其對脂肪干細(xì)胞增殖分化的影響[J];華西口腔醫(yī)學(xué)雜志;2012年06期

2 Sibel Yildirim;Susan Y. Fu;Keith Kim;Chang Hun Lee;Sahng Gyoon Kim;Jeremy J. Mao;;Tooth regeneration: a revolution in stomatology and evolution in regenerative medicine[J];International Journal of Oral Science;2011年03期

3 李景輝;張方明;張振庭;;人恒牙牙髓干細(xì)胞體外定向誘導(dǎo)分化為成骨細(xì)胞的研究[J];北京口腔醫(yī)學(xué);2011年03期

4 沈晴f3;;不同原代培養(yǎng)方法培養(yǎng)人牙髓細(xì)胞的研究[J];天津醫(yī)藥;2011年02期

5 賀慧霞;金巖;史俊南;許玉和;陸守昌;王新文;劉源;;礦化液對人牙髓干細(xì)胞生物學(xué)特性的影響[J];現(xiàn)代口腔醫(yī)學(xué)雜志;2008年06期

6 段建民;菊地寬高;汪維健;片山直;;血小板血漿對人牙髓細(xì)胞增殖的影響[J];牙體牙髓牙周病學(xué)雜志;2006年04期

7 馬西;纖維蛋白形成與降解[J];微循環(huán)學(xué)雜志;2002年04期

本文編號：2602187