【摘要】：泛素-蛋白酶體系統(tǒng)是細(xì)胞內(nèi)高度特異性的蛋白質(zhì)降解方式,也是一種重要的蛋白質(zhì)翻譯后修飾。泛素化修飾參與植物非生物脅迫響應(yīng)、細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等眾多生理過程。干旱脅迫是影響馬鈴薯生長發(fā)育和產(chǎn)量的主要因素之一,提高馬鈴薯的抗旱能力是目前馬鈴薯遺傳改良的重要任務(wù)。本研究對馬鈴薯泛素化修飾蛋白進(jìn)行了高通量篩選,并對U-box泛素連接酶基因家族和StPUB27參與干旱脅迫的機(jī)制進(jìn)行了系統(tǒng)研究,主要方法和結(jié)果如下:1.對馬鈴薯進(jìn)行滲透脅迫,用qRT-PCR技術(shù)檢測泛素(Ub)和26S蛋白酶體(26S)基因相對表達(dá)量;并用K-ε-GG抗體對胰蛋白酶水解后的馬鈴薯總蛋白進(jìn)行泛素化修飾肽段富集,用LC-MS/MS技術(shù)對泛素化修飾肽段進(jìn)行鑒定,然后用生物信息學(xué)技術(shù)進(jìn)行分析。結(jié)果表明,滲透脅迫下馬鈴薯26S基因表達(dá)量上升,泛素化水平提高;LC-MS/MS分析共檢測到泛素化修飾位點(diǎn)314個(gè),分布在200個(gè)修飾蛋白上;其中差異修飾位點(diǎn)25個(gè),包括3個(gè)顯著下調(diào)和22個(gè)顯著上調(diào)。2.對干旱脅迫下馬鈴薯進(jìn)行RNA-seq分析,從中篩選常用內(nèi)參基因進(jìn)一步分析干旱脅迫、滲透脅迫和自主設(shè)計(jì)的模擬干旱脅迫下最穩(wěn)定的內(nèi)參基因。結(jié)果表明:干旱脅迫和模擬干旱脅迫下最適合的內(nèi)參基因是EF1α,滲透脅迫下最適合的內(nèi)參基因是sec3,并且EF1α和sec3在三種處理下均表現(xiàn)出最佳的表達(dá)穩(wěn)定性。3.利用U-box保守序列構(gòu)建本地隱馬爾科夫模型,然后對馬鈴薯基因組數(shù)據(jù)庫進(jìn)行檢索,同時(shí)利用擬南芥和水稻已經(jīng)鑒定的U-box基因進(jìn)行BLAST搜索,對得到的馬鈴薯U-box家族成員進(jìn)行特征分析。結(jié)果共檢索到馬鈴薯U-box基因66個(gè),其中23個(gè)含有ARM結(jié)構(gòu)域;66個(gè)StPUB基因分布在10條染色體上,且基因結(jié)構(gòu)差異明顯,有37個(gè)StPUB基因的外顯子在2個(gè)以上,同時(shí)也有29個(gè)基因是連續(xù)基因;進(jìn)化關(guān)系分析發(fā)現(xiàn)大多數(shù)St PUB基因與物種內(nèi)U-box基因遺傳距離比物種間更接近,并且鈴薯U-box家族基因中存在大量旁系特異性擴(kuò)張的基因,它們具有高度同源性,且往往串聯(lián)分布在染色體上。4.從馬鈴薯栽培品種“Atlantic”和“青薯9號”中分別克隆得到StPUB27,并進(jìn)行序列比對和結(jié)構(gòu)分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同品種中StPUB27基因CDS全長均為2049 bp;序列比對發(fā)現(xiàn)“Atlantic”、“青薯9號”與測序二倍體材料“DM1-3(Solanum phureja)”的StPUB27基因CDS區(qū)和氨基酸均高度保守,同源性分別為97.66%和96.33%。進(jìn)化樹分析發(fā)現(xiàn)StPUB27基因與野生番茄(Solanum pennellii)和番茄(Solanum lycopersicum)中同源基因的親緣關(guān)系最近;信號肽分析發(fā)現(xiàn)StPUB27蛋白不含信號肽,不屬于分泌蛋白。亞細(xì)胞定位預(yù)測發(fā)現(xiàn)StPUB27蛋白最可能在線粒體發(fā)揮生物學(xué)功能,屬于核編碼的線粒體蛋白。分析StPUB27基因啟動(dòng)元件發(fā)現(xiàn)在上游1000 bp序列中存在多個(gè)響應(yīng)非生物脅迫的順式作用元件和激素應(yīng)答順式作用元件,如CCAAT-box、MRE和CGTCA-motif。以plakophilin 1為模板進(jìn)行空間結(jié)構(gòu)同源建模,最終預(yù)測到“Atlantic”和“青薯9號”StPUB27空間三維結(jié)構(gòu)高度相似。5.構(gòu)建了強(qiáng)組成型啟動(dòng)子CaMV 35S驅(qū)動(dòng)的St PUB27基因的過表達(dá)載體CaMV35S-pCPB-StPUB27和RNAi載體pHellsgate8-stpub27,轉(zhuǎn)化馬鈴薯并進(jìn)一步分析StPUB27基因的功能。結(jié)果表明St PUB27基因過表達(dá)能夠加快轉(zhuǎn)基因植株離體葉片失水,過表達(dá)植株的葉片擁有更大的氣孔導(dǎo)度,但其脯氨酸含量并未顯著變化,這預(yù)示著StPUB27基因并不參與泛素化降解途徑,更有可能參與泛素化修飾調(diào)節(jié)靶蛋白的活性。綜上所述,本研究表明泛素-蛋白酶體系統(tǒng)與馬鈴薯干旱響應(yīng)密切相關(guān),馬鈴薯U-box泛素連接酶基因家族含有66個(gè)成員,StPUB27基因參與馬鈴薯氣孔調(diào)節(jié)并負(fù)調(diào)控馬鈴薯干旱耐受性;另外,EF1α和sec3基因是干旱脅迫、滲透脅迫和模擬干旱脅迫下最穩(wěn)定的內(nèi)參基因。
【圖文】：

圖 1.1 泛素-蛋白酶體系統(tǒng)示意圖[59-61]Figure 1.1 Ubiquitin and the ubiquitin proteasome system[59-61]A：泛素級聯(lián)反應(yīng)的過程；B：泛素化修飾的類型；C：U-box 泛素連接酶直接將 Ub 轉(zhuǎn)移到靶蛋白上。A: Ubiquitination pathway. B: Possible arrangement of ubiquitin modifications on the targprotein. C: Substrate ubiquitination directly transfer Ub from E2 to the substrate by U-box ligase.

圖 1.2 泛素化修飾蛋白富集和分析原理[127]Figure 1.2 Ubiquitin-modified protein enrichment and analysis[127]1.5 本研究的目的和意義干旱脅迫是影響馬鈴薯生長發(fā)育和產(chǎn)量的主要非生物脅迫之一，，提高馬鈴薯
【學(xué)位授予單位】：甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：S532

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2599338