【摘要】：泛素-蛋白酶體系統(tǒng)是細胞內高度特異性的蛋白質降解方式,也是一種重要的蛋白質翻譯后修飾。泛素化修飾參與植物非生物脅迫響應、細胞信號轉導等眾多生理過程。干旱脅迫是影響馬鈴薯生長發(fā)育和產量的主要因素之一,提高馬鈴薯的抗旱能力是目前馬鈴薯遺傳改良的重要任務。本研究對馬鈴薯泛素化修飾蛋白進行了高通量篩選,并對U-box泛素連接酶基因家族和StPUB27參與干旱脅迫的機制進行了系統(tǒng)研究,主要方法和結果如下:1.對馬鈴薯進行滲透脅迫,用qRT-PCR技術檢測泛素(Ub)和26S蛋白酶體(26S)基因相對表達量;并用K-ε-GG抗體對胰蛋白酶水解后的馬鈴薯總蛋白進行泛素化修飾肽段富集,用LC-MS/MS技術對泛素化修飾肽段進行鑒定,然后用生物信息學技術進行分析。結果表明,滲透脅迫下馬鈴薯26S基因表達量上升,泛素化水平提高;LC-MS/MS分析共檢測到泛素化修飾位點314個,分布在200個修飾蛋白上;其中差異修飾位點25個,包括3個顯著下調和22個顯著上調。2.對干旱脅迫下馬鈴薯進行RNA-seq分析,從中篩選常用內參基因進一步分析干旱脅迫、滲透脅迫和自主設計的模擬干旱脅迫下最穩(wěn)定的內參基因。結果表明:干旱脅迫和模擬干旱脅迫下最適合的內參基因是EF1α,滲透脅迫下最適合的內參基因是sec3,并且EF1α和sec3在三種處理下均表現(xiàn)出最佳的表達穩(wěn)定性。3.利用U-box保守序列構建本地隱馬爾科夫模型,然后對馬鈴薯基因組數據庫進行檢索,同時利用擬南芥和水稻已經鑒定的U-box基因進行BLAST搜索,對得到的馬鈴薯U-box家族成員進行特征分析。結果共檢索到馬鈴薯U-box基因66個,其中23個含有ARM結構域;66個StPUB基因分布在10條染色體上,且基因結構差異明顯,有37個StPUB基因的外顯子在2個以上,同時也有29個基因是連續(xù)基因;進化關系分析發(fā)現(xiàn)大多數St PUB基因與物種內U-box基因遺傳距離比物種間更接近,并且鈴薯U-box家族基因中存在大量旁系特異性擴張的基因,它們具有高度同源性,且往往串聯(lián)分布在染色體上。4.從馬鈴薯栽培品種“Atlantic”和“青薯9號”中分別克隆得到StPUB27,并進行序列比對和結構分析。結果發(fā)現(xiàn)不同品種中StPUB27基因CDS全長均為2049 bp;序列比對發(fā)現(xiàn)“Atlantic”、“青薯9號”與測序二倍體材料“DM1-3(Solanum phureja)”的StPUB27基因CDS區(qū)和氨基酸均高度保守,同源性分別為97.66%和96.33%。進化樹分析發(fā)現(xiàn)StPUB27基因與野生番茄(Solanum pennellii)和番茄(Solanum lycopersicum)中同源基因的親緣關系最近;信號肽分析發(fā)現(xiàn)StPUB27蛋白不含信號肽,不屬于分泌蛋白。亞細胞定位預測發(fā)現(xiàn)StPUB27蛋白最可能在線粒體發(fā)揮生物學功能,屬于核編碼的線粒體蛋白。分析StPUB27基因啟動元件發(fā)現(xiàn)在上游1000 bp序列中存在多個響應非生物脅迫的順式作用元件和激素應答順式作用元件,如CCAAT-box、MRE和CGTCA-motif。以plakophilin 1為模板進行空間結構同源建模,最終預測到“Atlantic”和“青薯9號”StPUB27空間三維結構高度相似。5.構建了強組成型啟動子CaMV 35S驅動的St PUB27基因的過表達載體CaMV35S-pCPB-StPUB27和RNAi載體pHellsgate8-stpub27,轉化馬鈴薯并進一步分析StPUB27基因的功能。結果表明St PUB27基因過表達能夠加快轉基因植株離體葉片失水,過表達植株的葉片擁有更大的氣孔導度,但其脯氨酸含量并未顯著變化,這預示著StPUB27基因并不參與泛素化降解途徑,更有可能參與泛素化修飾調節(jié)靶蛋白的活性。綜上所述,本研究表明泛素-蛋白酶體系統(tǒng)與馬鈴薯干旱響應密切相關,馬鈴薯U-box泛素連接酶基因家族含有66個成員,StPUB27基因參與馬鈴薯氣孔調節(jié)并負調控馬鈴薯干旱耐受性;另外,EF1α和sec3基因是干旱脅迫、滲透脅迫和模擬干旱脅迫下最穩(wěn)定的內參基因。
【圖文】：

圖 1.1 泛素-蛋白酶體系統(tǒng)示意圖[59-61]Figure 1.1 Ubiquitin and the ubiquitin proteasome system[59-61]A：泛素級聯(lián)反應的過程；B：泛素化修飾的類型；C：U-box 泛素連接酶直接將 Ub 轉移到靶蛋白上。A: Ubiquitination pathway. B: Possible arrangement of ubiquitin modifications on the targprotein. C: Substrate ubiquitination directly transfer Ub from E2 to the substrate by U-box ligase.

圖 1.2 泛素化修飾蛋白富集和分析原理[127]Figure 1.2 Ubiquitin-modified protein enrichment and analysis[127]1.5 本研究的目的和意義干旱脅迫是影響馬鈴薯生長發(fā)育和產量的主要非生物脅迫之一，，提高馬鈴薯
【學位授予單位】：甘肅農業(yè)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：S532

【參考文獻】

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本文編號：2599338