【摘要】：figla(factor in the germline alpha)是bHLH(basic helix-loop-helix,堿性螺旋-環(huán)-螺旋)家族的一員,在動物的生殖發(fā)育調控過程中起著極為重要的作用,特別是在大部分脊椎動物的卵泡形成及卵巢發(fā)育中起著重要的調控作用。figla基因具有高度保守的bHLH結構域,已在部分脊椎動物中得到鑒定與分析。中華鱉(Pelodiscus sinensis)是爬行類動物中較為普遍的種類,因其具有極高的藥用和營養(yǎng)價值,導致其資源的過度開發(fā)利用及環(huán)境的惡化,致使中華鱉種質退化嚴重。因此利用傳統(tǒng)選育與現代細胞、基因工程等育種技術相結合的新方法進行良種培育已變得至關重要。生殖細胞是育種新技術研究的細胞基礎,中華鱉生殖細胞發(fā)育分化的研究是進一步了解其生殖發(fā)育調控機制的前提。本論文以中華鱉為實驗模型,對figla基因在其生殖細胞發(fā)育中的表達模式進行了初步分析,詳細的工作內容如下:1.中華鱉figla基因的克隆及分析本研究克隆并分析了中華鱉figla基因的部分cDNA序列,該序列長度為714bp,其中包含完整開放閱讀框642 bp,3’端非編碼區(qū)72 bp;共編碼213個氨基酸,包含一個高度保守的bHLH結構域。Figla氨基酸序列比對結果顯示,其蛋白序列與西部錦龜同源性最高,達93%;此外,NJ系統(tǒng)進化樹的分析結果顯示,中華鱉Figla蛋白與哺乳類、鳥類的聚為一支。2.中華鱉figla的組織特異性分析半定量PCR和熒光定量PCR(qRT-PCR)結果表明:中華鱉figla基因mRNA主要在卵巢和精巢中表達,其中在卵巢中表達較強,精巢中表達較弱,而在其它體組織中幾乎不表達。3.中華鱉figla mRNA在卵巢中的表達分布情況由中華鱉卵巢組織的化學和熒光原位雜交結果可知:中華鱉figlamRNA在卵子發(fā)生過程中的各期卵泡中均有信號,其中在初級卵母細胞(Ⅱ-Ⅴ期)中的信號最強,且主要定位在卵母細胞胞質中;在生長期卵母細胞(Ⅵ-Ⅸ期)發(fā)育至成熟卵母細胞(Ⅹ期)的過程中,figlamRNA分布在卵母細胞胞質及其外周的濾泡細胞中,且在卵母細胞胞質中的信號逐漸減弱,在濾泡細胞中的信號逐漸增強。研究結果表明figla基因可能主要調控中華鱉卵泡形成及卵巢的發(fā)育。4.中華鱉figla mRNA在精巢中的表達分布情況中華鱉figla mRNA在精子發(fā)生中各時期的細胞中表現出動態(tài)的變化。中華鱉figlamRNA在精母細胞和精子細胞中的信號較強,在精原細胞中的信號較弱,在體細胞中幾乎檢測不到信號。研究結果表明figla基因可能在精母細胞和精子細胞發(fā)育過程中也起到一定的調控作用。綜上所述,figla基因可作為中華鱉卵泡和卵母細胞發(fā)育的關鍵基因,參與調控卵泡的形成及卵巢發(fā)育,同時可能在中華鱉精子發(fā)生過程中也起到一定的調控作用。本研究為進一步開展中華鱉及其它爬行動物的配子生成、性腺發(fā)育與分化等研究奠定了基礎。
【圖文】：

15圖 1-1 中華鱉 figlɑ cDNA 的核苷酸序列和氨基酸序列起始密碼子（ATG）和終止密碼子（TAA）用黑體加粗所示；bHLH 保守功能域用灰色陰影所示。Fig. 1-1 Nucleotide and proteins sequences of Pelodiscus sinensis figlɑ cDNAThe translation start codon ATG, stop codon TAA are shown in bold; bHLH conserved domain arehighlighted with grey shadow.

圖 1-3 NJ 法構建系統(tǒng)進化樹線的長度與遺傳距離成正比，中華鱉用“●”表示。構建系統(tǒng)樹所用各脊椎動物的 Figla 氨基酸序列如下：西部錦龜（Chrysemys picta bellii，XP_005285304.1），非洲爪蟾（Xenopus tropicalis，CAJ82168.1），安樂蜥（Anolis carolinensis，XP_008120436.1），家鼠（Mus musculus，NP_036143.1），人（Homo sapiens，NP_001004311.2），牛（Bos taurus，NP_001268849），普 通 珠 雞 (Numida meleagris ， XP_021230749.1 ） ， 藍 冠 嬌 瀇 （ Lepidothrix coronata ，XP_017692764.1），斑馬魚（Danio rerio，NP_944601.2），，銀鮭（Oncorhynchus kisutch，XP_020344386），青溕（Oryzias latipes，NP_001098215.1），紅鰭東方渶（Takifugu rubripes，NP_001177290 ） ， 半 滑 舌 鰨 （ Cynoglossus semilaevis ， XM_017042726 ） ， 多 棘 雀 鯛（Acanthochromis polyacanthus，XP_022074641.1），尼羅羅非魚（Oreochromis niloticus，AJP62204.1）。Fig.1-3 Phylogenetic tree established by the neighbor-joining methodThe size of the phylogenetic tree is in propotion to the genetic distance, and the Figla of Pelodiscussinensis is highlighted by the black dot. The amino acid sequences used in this study are as follows:
【學位授予單位】：上海海洋大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：S917.4

【參考文獻】

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本文編號：2599323