【摘要】：目的:STAT1保護(hù)宿主細(xì)胞免受病毒和其他病原體感染,在先天性免疫中起到重要作用。STAT1在腫瘤細(xì)胞中具有促凋亡和抗增殖活性,在細(xì)胞信號傳導(dǎo)過程中起重要作用。然而STAT1在肝細(xì)胞癌中的調(diào)控機(jī)制知之甚少。為了研究stat1表達(dá)的調(diào)控機(jī)制,我們用生物信息學(xué)軟件對stat1啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行分析和預(yù)測,并進(jìn)行驗(yàn)證,發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄因子HSF4與STAT1表達(dá)具有相關(guān)性。SMMC-7721中hsf4的RNAi沉默升高STAT1 mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)。通過ChIP-seq分析鑒定出STAT1基因的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)(TSS)上游254-489bp的啟動(dòng)子區(qū)域中的HSF4結(jié)合位點(diǎn),預(yù)測的結(jié)合位點(diǎn)恰好在該區(qū)域內(nèi)并且通過以下EMSA實(shí)驗(yàn)得到驗(yàn)證。當(dāng)與HSF4共轉(zhuǎn)染時(shí),stat1的啟動(dòng)子活性通過熒光素酶報(bào)告基因測定來確定。在SMMC-7721中RNAi沉默HSF4后觀察到細(xì)胞增殖減少和細(xì)胞凋亡增加。我們的研究結(jié)果將stat1鑒定為HSF4在SMMC-7721細(xì)胞系中的新轉(zhuǎn)錄靶標(biāo),從而為開發(fā)肝細(xì)胞癌治療策略提供了基礎(chǔ)。目前對stat1的研究,主要關(guān)注其本身的功能,stat1的表達(dá)調(diào)控機(jī)制尚未清楚,深入研究stat1有助于揭示腫瘤發(fā)生發(fā)展的機(jī)制,本實(shí)驗(yàn)擬從轉(zhuǎn)錄因子層面對stat1的調(diào)控機(jī)制進(jìn)行研究。研究方法:(1)細(xì)胞培養(yǎng)人肝正常細(xì)胞系L-02、人肝癌細(xì)胞HepG2、SMMC-7721培養(yǎng)于DMEM培養(yǎng)液(含10%小牛血清),置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。(2)轉(zhuǎn)錄因子預(yù)測篩選用生物信息學(xué)軟件JASPAR預(yù)測,可能與stat1啟動(dòng)子區(qū)結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子,對預(yù)測出的轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行篩選,找出候選基因。(3)HSF4 siRNA干擾和建立高表達(dá)細(xì)胞系慢病毒方法,HSF4的siRNA干擾片段干擾SMMC-7721細(xì)胞系將HSF4全基因序列克隆到載體pEX-4中,形成pEX-4-HSF4表達(dá)質(zhì)粒。(4)Real-time PCR檢測mRNA表達(dá)Real-time PCR檢測SMMC-7721細(xì)胞系HSF4和stat1的表達(dá),及siRNA干擾和轉(zhuǎn)染前后轉(zhuǎn)錄因子HSF4和啟動(dòng)子stat1的mRNA表達(dá)情況。(轉(zhuǎn)染前后)(5)Western Blot Western Blot檢測siRNA干擾和轉(zhuǎn)染SMMC-7721細(xì)胞系前后,HSF4和STAT1的蛋白表達(dá)情況。(6)Ch IP-sequencing提取全基因組DNA進(jìn)行ChIP-sequencing,獲取SMMC-7721細(xì)胞系中與HSF4結(jié)合全基因組DNA。將Ch IP-seq提供HSF4結(jié)合區(qū)域,與JESPAR預(yù)測結(jié)果進(jìn)行序列對比,找出stat1與HSF4結(jié)合位點(diǎn)。(7)熒光素酶報(bào)告基因?qū)⒃摕晒馑孛笀?bào)告基因質(zhì)粒與hsf4基因表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染到hek293細(xì)胞中,觀察轉(zhuǎn)染前后熒光素表達(dá)情況。(8)凋亡實(shí)驗(yàn)用PE-7AAD凋亡試劑/流式細(xì)胞儀檢測HSF4干擾前后SMMC-7721細(xì)胞凋亡情況。(9)對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用圖像采集分析系統(tǒng)分析數(shù)據(jù),所得數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,應(yīng)用統(tǒng)計(jì)軟件,用單因素方差分析進(jìn)行組間比較,P0.5為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,P0.01為有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果:一.JASPER軟件預(yù)測轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)通過生物信息學(xué)軟件JASPAR,預(yù)測出可以與stat1啟動(dòng)子區(qū)相結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子,從中篩選出轉(zhuǎn)錄因子HSF4。二、檢測HSF4與stat1表達(dá)的相關(guān)性我們對HSF4和stat1進(jìn)行Realtime PCR和Western Blot檢測,發(fā)現(xiàn)在SMMC-7721細(xì)胞系中均表達(dá)趨勢相反,提示HSF4與stat1表達(dá)具有相關(guān)性。三、siRNA干擾方法,檢測HSF4對STAT1表達(dá)的調(diào)控作用siRNA干擾SMMC-7721細(xì)胞系的HSF4表達(dá),Realtime PCR、Western Blot檢測,發(fā)現(xiàn)stat1在SMMC-7721細(xì)胞系中表達(dá)升高,提示HSF4對STAT1表達(dá)有調(diào)控作用。四、Ch IP-sequencing通過生物信息學(xué)軟件預(yù)測并確定轉(zhuǎn)錄因子為HSF4后,再進(jìn)一步做HSF4的chip-s,并在啟動(dòng)子區(qū)找到了stat1結(jié)合位點(diǎn)。五、熒光素酶報(bào)告基因檢測轉(zhuǎn)錄因子HSF4和其啟動(dòng)子STAT1中的特異順序結(jié)合。通過敲除轉(zhuǎn)錄因子HSF4來檢測啟動(dòng)子STAT1的變化活性。六、凋亡實(shí)驗(yàn)進(jìn)步通過生物學(xué)實(shí)驗(yàn),驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄因子HSF4和啟動(dòng)子STAT1的調(diào)控關(guān)系。結(jié)論:初步證明,人肝癌細(xì)胞系SMMC-7721中,HSF4調(diào)控STAT1的表達(dá),并找到HSF4與STAT1結(jié)合區(qū)域。
【圖文】：

圖 3.2 SMMC-7721 細(xì)胞系中 HSF4 與 STAT1 表達(dá)呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)A：分別提取 L-02、SMMC-7721 細(xì)胞總 RNA，反轉(zhuǎn)錄后，并用相同質(zhì)量數(shù)的 cDNA 作為模板進(jìn)行 Real-time PCR 反應(yīng)檢測 hsf4 和 stat1 的 mRNA 表達(dá)情況。（p<0.05，n=6）B：分別在 L-02 和 SMMC-7721 細(xì)胞系中，HSF4 和 STAT1 的 Western Blot 檢測結(jié)果, 以及Western Blot 灰度值檢測結(jié)果3.3 HSF4 對 stat1 表達(dá)有負(fù)調(diào)控作用3.3.1 用 RNA 干擾技術(shù)干擾腫瘤細(xì)胞為了進(jìn)一步驗(yàn)證 hsf4 對 stat1 基因表達(dá)的調(diào)控作用，我們采用 RNAi 方法干擾SMMC-7721 細(xì)胞系中 hsf4 基因的表達(dá)，觀察其對 STAT1 的表達(dá)影響。結(jié)果顯示，，HSF4 基因表達(dá)降低時(shí)，SMMC-7721 細(xì)胞系中 STAT1 的表達(dá)明顯升高，圖 3.3.1。

圖 3.3.1 SMMC-7721 細(xì)胞系病毒轉(zhuǎn)染后，HSF4 和 STAT1 的 mRNA 和蛋白的表達(dá)水平A：RNAi 干擾結(jié)果，通過慢病毒轉(zhuǎn)染，熒光顯微鏡下可見綠色顆粒，證明慢病毒轉(zhuǎn)染成功。B：Real-Time PCR 檢測慢病毒轉(zhuǎn)染前后 HSF4 的 RNA 表達(dá) (P<0.05，n=3)，GAPDH 基因的mRNA 表達(dá)水平作為內(nèi)參，顯示 HSF4 表達(dá)降低。C：Real-Time PCR 檢測干擾前后 STAT1 的 RNA 表達(dá)（p<0.05，n=3），圖中數(shù)據(jù)為以 2-△△Ct的方法計(jì)算得到的來自三次相互獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)的平均值+-標(biāo)準(zhǔn)差的結(jié)果。D：Westernn Blot 檢測干擾轉(zhuǎn)錄因子 HSF4 后，HSF4 和 STAT1 的蛋白表達(dá)。E：Westernn Blot 檢測干擾轉(zhuǎn)錄因子 HSF4 后，HSF4 和 STAT1 的蛋白表達(dá)差異灰度值3.3.2 轉(zhuǎn)染 HSF4 質(zhì)粒檢測轉(zhuǎn)染前后 STAT1 和 HSF4 的表達(dá)量構(gòu)建 HSF4 表達(dá)質(zhì)粒，并將其轉(zhuǎn)染到 SMMC-7721 細(xì)胞系中，并用 Real-time PCR和 Western Blot 檢測轉(zhuǎn)染前后 HSF4 和 STAT1 基因的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，HSF4表達(dá)升高，STAT1 的表達(dá)降低，二者有顯著性差異，如圖 3.3.2。
【學(xué)位授予單位】：中國醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R735.7

【參考文獻(xiàn)】

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1 范賢明;張世波;劉春濤;熊彬;王曾禮;;STAT1反義寡核苷酸對肺纖維化大鼠肺泡巨噬細(xì)胞分泌TNF-α、IL-8和NO的影響[J];細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志;2006年04期

本文編號：2595811