【摘要】：目的:本課題依托團(tuán)隊(duì)前期哈薩克族和維吾爾族食管鱗癌患者外顯子測(cè)序結(jié)果,分析凝血酶敏感蛋白1型7a(Thsd7a)基因在新疆四個(gè)民族食管鱗癌的表達(dá)差異,闡述哈薩克族食管鱗癌組織中Thsd7a表達(dá)水平與食管癌臨床惡性表型、預(yù)后的關(guān)系。進(jìn)一步探究Thsd7a對(duì)于食管鱗癌細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲等生物學(xué)行為的影響及在食管鱗癌中發(fā)揮作用的通路;在基因芯片發(fā)現(xiàn)的Thsd7a疑似下游基因基礎(chǔ)上,通過(guò)下游驅(qū)動(dòng)基因篩選及體內(nèi)外功能試驗(yàn),明確Thsd7a下游新驅(qū)動(dòng)基因,分析食管鱗癌組織中Thsd7a下游驅(qū)動(dòng)基因的臨床意義,探究下游基因在腫瘤發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的生物學(xué)功能,為食管癌的個(gè)體化靶向治療和進(jìn)一步臨床應(yīng)用等研究奠定基礎(chǔ)。方法:(1)按照2009年第七版的食管癌TNM分期標(biāo)準(zhǔn),分別入選四個(gè)民族的食管癌患者并收集組織標(biāo)本。通過(guò)石蠟包埋組織免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)Thsd7a在癌和癌旁組織的表達(dá)情況。針對(duì)表達(dá)有顯著差異的民族(哈薩克族),進(jìn)一步通過(guò)RT-PCR檢測(cè)目的基因在mRNA水平的表達(dá)情況,明確Thsd7a是否存在民族差異以及表達(dá)的特點(diǎn);(2)在明確Thsd7a在哈薩克族食管癌組織中表達(dá)顯著的情況下,分析Thsd7a的表達(dá)變化與哈薩克族食管鱗癌病理分期、浸潤(rùn)深度等臨床病理指標(biāo)的相關(guān)性,以及與患者預(yù)后的關(guān)聯(lián)性;(3)在臨床樣本的基礎(chǔ)上,通過(guò)構(gòu)建Thsd7a的干擾質(zhì)粒載體和慢病毒載體從體外細(xì)胞水平,檢測(cè)Thsd7a對(duì)食管鱗癌細(xì)胞增殖、凋亡、遷移、侵襲等細(xì)胞功能的影響;(4)在體外細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上,通過(guò)構(gòu)建裸鼠移植瘤體模型,觀察瘤體生長(zhǎng)情況等,進(jìn)一步明確Thsd7a基因?qū)?xì)胞生長(zhǎng)的影響;(5)對(duì)Eca 109細(xì)胞敲減Thsd7a基因后,采用高通量基因芯片篩查和驗(yàn)證Thsd7a功能相關(guān)關(guān)鍵信號(hào)通路;(6)在基因芯片發(fā)現(xiàn)的疑似下游食管癌相關(guān)基因基礎(chǔ)上,細(xì)胞水平采用RT-PCR確認(rèn)疑似基因與Thsd7a的上下游關(guān)系;(7)在目的基因3個(gè)干擾靶序列預(yù)混后,采用Celigo實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng),統(tǒng)計(jì)分析出最顯著影響細(xì)胞生長(zhǎng)的下游驅(qū)動(dòng)基因;(8)再次采用Celigo進(jìn)行顯著差異基因的單靶點(diǎn)驗(yàn)證;(9)針對(duì)單靶點(diǎn)驗(yàn)證的陽(yáng)性基因,進(jìn)一步采用細(xì)胞功能學(xué)實(shí)驗(yàn)(MTT、克隆形成實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡、劃痕實(shí)驗(yàn)、transwell遷移實(shí)驗(yàn)、Western blot)驗(yàn)證目的基因功能;(10)通過(guò)3個(gè)食管鱗癌細(xì)胞目的基因外顯子測(cè)序,探索基因功能的根源。結(jié)果:第一部分:(1)免疫組織化學(xué)檢測(cè)Thsd7a在各民族正常食管和ESCC組織中的蛋白表達(dá)情況:100例維吾爾族、100例漢族和11例蒙古族ESCC組織中Thsd7a蛋白陽(yáng)性表達(dá)率分別為35.0%、28.0%和27.3%,87例維吾爾族、94例漢族和9例蒙古族癌旁正常對(duì)照組織中Thsd7a陽(yáng)性表達(dá)率分別為29.9%、19.2%和33.3%。維吾爾族、漢族和蒙古族正常食管組織Thsd7a蛋白陽(yáng)性率與ESCC組織差異不顯著。而哈薩克族癌旁正常對(duì)照組織Thsd7a蛋白陽(yáng)性率明顯低于ESCC組織;(2)免疫組化和RT-PCR實(shí)驗(yàn)均顯示哈薩克族食管鱗癌患者的癌組織中Thsd7a的表達(dá)量顯著高于癌旁正常組織,且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;(3)Thsd7a的表達(dá)與臨床分期(P=0.04)和分化程度(P0.01)具有顯著相關(guān)性。即臨床期別越晚,腫瘤分化程度較高的情況下,Thsd7a的表達(dá)率越高;(4)Thsd7a的表達(dá)量與預(yù)后沒(méi)有顯著相關(guān)性,但臨床分期、T分期和N分期以及分化程度與哈薩克族食管鱗癌患者的預(yù)后相關(guān)。COX多因素分析顯示臨床分期和T/N分期,是預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。第二部分:(1)敲減Thsd7a后,MTT實(shí)驗(yàn)顯示EC 9706和Eca 109的增殖活性均顯著受到了抑制;細(xì)胞劃痕和transwell遷移實(shí)驗(yàn)顯示,EC 9706和Eca 109細(xì)胞的遷移能力受到了顯著的抑制;侵襲實(shí)驗(yàn)顯示,EC 9706和Eca 109細(xì)胞株的侵襲能力在敲減Thsd7a后受到了顯著的抑制,說(shuō)明了目的基因能夠分泌金屬蛋白酶,具有較強(qiáng)侵襲能力;流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn),敲減Thsd7a能夠使得細(xì)胞周期阻滯在G0/G1期,且細(xì)胞凋亡率明顯增加;(2)裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)顯示,敲減Thsd7a能夠有效的抑制Eca 109細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)的成瘤能力;(3)采用微陣列基因芯片檢測(cè)Thsd7a敲減后Eca 109細(xì)胞中mRNA表達(dá)水平發(fā)生顯著差異的基因和信號(hào)通路。進(jìn)一步RT-PCR驗(yàn)證后,發(fā)現(xiàn)Thsd7a與五個(gè)經(jīng)典通路顯著相關(guān),分別為:mTOR通路、Cell Cycle G1/S Checkpoint通路、Wnt通路、AMPK通路和ERK/MAPK通路。第三部分:(1)采用生物信息學(xué)的方法分析基因芯片對(duì)應(yīng)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果:首先在PUBMED進(jìn)行基因已發(fā)表文章的篩選,入選標(biāo)準(zhǔn)為報(bào)道數(shù)量少于100篇,在腫瘤中研究比較少,且在食管癌中沒(méi)有報(bào)道過(guò)的基因。通過(guò)以上的篩選條件,挑選出37個(gè)候選基因;(2)將anti-Thsd7a shRNA轉(zhuǎn)染到Eca 109細(xì)胞實(shí)現(xiàn)Thsd7a基因的穩(wěn)定敲減,從而觀察體外細(xì)胞水平Thsd7a顯著相關(guān)的下游基因。結(jié)果發(fā)現(xiàn),其中11個(gè)基因下調(diào)顯著(40%),因此對(duì)這11個(gè)基因進(jìn)行功能學(xué)篩選。(3)對(duì)目的基因逐一設(shè)計(jì)3個(gè)干擾靶點(diǎn)進(jìn)行混合,并轉(zhuǎn)染到Eca 109細(xì)胞。通過(guò)Celigo儀高通量實(shí)時(shí)檢測(cè)的方法,結(jié)果發(fā)現(xiàn)2個(gè)基因(SCARA5和SMCO4)能夠顯著影響食管鱗癌細(xì)胞增殖能力。并進(jìn)一步通過(guò)單靶點(diǎn)Celigo驗(yàn)證的方法,證實(shí)并明確了敲減效率顯著的干擾序列shSCARA5(PSC38272)和shSMCO4(PSC37528)。(4)SCARA5在食管癌細(xì)胞系的本底表達(dá)檢測(cè)顯示,SCARA5在Eca 109和EC 9706細(xì)胞中表現(xiàn)為高表達(dá),在TE-1細(xì)胞中表現(xiàn)為低表達(dá)。(5)敲減SCARA5后,MTT實(shí)驗(yàn)顯示體外食管癌細(xì)胞系Eca 109的增殖活性受到了顯著抑制;細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)顯示,Eca 109的細(xì)胞克隆形成能力受到顯著抑制;細(xì)胞劃痕和transwell遷移實(shí)驗(yàn)顯示,Eca 109細(xì)胞的遷移能力受到了顯著的抑制;流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn),敲減SCARA5能夠使得細(xì)胞周期阻滯在S期和G2/M期,且細(xì)胞凋亡率明顯增加。(6)外顯子測(cè)序結(jié)果顯示,SCARA5表現(xiàn)為促癌功能可能是因?yàn)樵摶?號(hào)外顯子的第30位基因序列出現(xiàn)CT錯(cuò)義突變(C/G)引起的。結(jié)論:(1)免疫組化實(shí)驗(yàn)檢測(cè)Thsd7a在維吾爾族、哈薩克族、漢族和蒙古族食管鱗癌和癌旁組織的表達(dá)情況。結(jié)果顯示,Thsd7a在維吾爾族、漢族和蒙古族的食管癌患者癌和癌旁表達(dá)差異不顯著,而在哈薩克族食管鱗癌和癌旁正常組織表達(dá)差異顯著;(2)Thsd7a在哈薩克族食管鱗癌組織中表達(dá)顯著,且Thsd7a表達(dá)與食管癌患者分化程度、臨床分期顯著相關(guān);(3)Thsd7a能抑制食管鱗癌細(xì)胞的凋亡,影響細(xì)胞周期,促進(jìn)癌細(xì)胞的增殖、遷移。在裸鼠移植瘤實(shí)驗(yàn)中,Thsd7a在體內(nèi)能夠促進(jìn)食管癌細(xì)胞生長(zhǎng),發(fā)揮著癌基因的作用;(4)Thsd7a發(fā)揮功能需要通過(guò)5個(gè)經(jīng)典腫瘤相關(guān)通路來(lái)完成。而且Thsd7a下游驅(qū)動(dòng)基因SCARA5,在食管癌細(xì)胞中同樣發(fā)揮促癌的功能;(5)通過(guò)食管癌細(xì)胞的外顯子測(cè)序發(fā)現(xiàn),抑癌基因SCARA5在食管癌細(xì)胞系中表現(xiàn)促癌功能,可能主要源于外顯子突變特別是5號(hào)外顯子的CT錯(cuò)義突變。本研究為食管癌的靶向治療提供了新的靶點(diǎn)和思路。
【圖文】：

第一部分·結(jié) 果達(dá)情況白在正常食管粘膜上皮散在分布，定位于細(xì)胞膜呈黃色陽(yáng)性細(xì)胞多呈巢形或灶形分布（見(jiàn)圖1-1）。100例維吾爾古族ESCC組織中Thsd7a蛋白陽(yáng)性表達(dá)率分別為35.0%（3527.3%（3/11），87例維吾爾族、94例漢族和9例蒙古族癌性表達(dá)率分別為29.9%（26/87）、19.2%（18/94）和33.3%和蒙古族正常食管組織Thsd7a蛋白陽(yáng)性率與ESCC組織相似.05，，表1)。117例哈薩克族ESCC組織中Thsd7a蛋白陽(yáng)性表111例正常食管組織中Thsd7a陽(yáng)性表達(dá)率為18.0%（20/111照組織Thsd7a蛋白陽(yáng)性率明顯低于ESCC組織,差異有1-3)。組織化學(xué)檢測(cè)Thsd7a在各民族正常食管和ESC

G：食管鱗癌組織（×200） H：食管鱗癌組織（×400）G：ESCC tissues（×200） H：ESCC tissues（×400）圖1-2 Thsd7a在哈薩克族食管鱗癌及癌旁正常食管組織中的表達(dá)Fig. 1-2 The expression of Thsd7a in Kazakh’s ESCC and adjacent normal tissuesa
【學(xué)位授予單位】：新疆醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類(lèi)號(hào)】：R735.1


本文編號(hào)：2595114