【摘要】：目的:本課題依托團隊前期哈薩克族和維吾爾族食管鱗癌患者外顯子測序結(jié)果,分析凝血酶敏感蛋白1型7a(Thsd7a)基因在新疆四個民族食管鱗癌的表達差異,闡述哈薩克族食管鱗癌組織中Thsd7a表達水平與食管癌臨床惡性表型、預后的關(guān)系。進一步探究Thsd7a對于食管鱗癌細胞增殖、凋亡、侵襲等生物學行為的影響及在食管鱗癌中發(fā)揮作用的通路;在基因芯片發(fā)現(xiàn)的Thsd7a疑似下游基因基礎(chǔ)上,通過下游驅(qū)動基因篩選及體內(nèi)外功能試驗,明確Thsd7a下游新驅(qū)動基因,分析食管鱗癌組織中Thsd7a下游驅(qū)動基因的臨床意義,探究下游基因在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中的生物學功能,為食管癌的個體化靶向治療和進一步臨床應用等研究奠定基礎(chǔ)。方法:(1)按照2009年第七版的食管癌TNM分期標準,分別入選四個民族的食管癌患者并收集組織標本。通過石蠟包埋組織免疫組織化學方法檢測Thsd7a在癌和癌旁組織的表達情況。針對表達有顯著差異的民族(哈薩克族),進一步通過RT-PCR檢測目的基因在mRNA水平的表達情況,明確Thsd7a是否存在民族差異以及表達的特點;(2)在明確Thsd7a在哈薩克族食管癌組織中表達顯著的情況下,分析Thsd7a的表達變化與哈薩克族食管鱗癌病理分期、浸潤深度等臨床病理指標的相關(guān)性,以及與患者預后的關(guān)聯(lián)性;(3)在臨床樣本的基礎(chǔ)上,通過構(gòu)建Thsd7a的干擾質(zhì)粒載體和慢病毒載體從體外細胞水平,檢測Thsd7a對食管鱗癌細胞增殖、凋亡、遷移、侵襲等細胞功能的影響;(4)在體外細胞學實驗基礎(chǔ)上,通過構(gòu)建裸鼠移植瘤體模型,觀察瘤體生長情況等,進一步明確Thsd7a基因?qū)毎L的影響;(5)對Eca 109細胞敲減Thsd7a基因后,采用高通量基因芯片篩查和驗證Thsd7a功能相關(guān)關(guān)鍵信號通路;(6)在基因芯片發(fā)現(xiàn)的疑似下游食管癌相關(guān)基因基礎(chǔ)上,細胞水平采用RT-PCR確認疑似基因與Thsd7a的上下游關(guān)系;(7)在目的基因3個干擾靶序列預混后,采用Celigo實時監(jiān)測細胞生長,統(tǒng)計分析出最顯著影響細胞生長的下游驅(qū)動基因;(8)再次采用Celigo進行顯著差異基因的單靶點驗證;(9)針對單靶點驗證的陽性基因,進一步采用細胞功能學實驗(MTT、克隆形成實驗、細胞周期、細胞凋亡、劃痕實驗、transwell遷移實驗、Western blot)驗證目的基因功能;(10)通過3個食管鱗癌細胞目的基因外顯子測序,探索基因功能的根源。結(jié)果:第一部分:(1)免疫組織化學檢測Thsd7a在各民族正常食管和ESCC組織中的蛋白表達情況:100例維吾爾族、100例漢族和11例蒙古族ESCC組織中Thsd7a蛋白陽性表達率分別為35.0%、28.0%和27.3%,87例維吾爾族、94例漢族和9例蒙古族癌旁正常對照組織中Thsd7a陽性表達率分別為29.9%、19.2%和33.3%。維吾爾族、漢族和蒙古族正常食管組織Thsd7a蛋白陽性率與ESCC組織差異不顯著。而哈薩克族癌旁正常對照組織Thsd7a蛋白陽性率明顯低于ESCC組織;(2)免疫組化和RT-PCR實驗均顯示哈薩克族食管鱗癌患者的癌組織中Thsd7a的表達量顯著高于癌旁正常組織,且差異有統(tǒng)計學意義;(3)Thsd7a的表達與臨床分期(P=0.04)和分化程度(P0.01)具有顯著相關(guān)性。即臨床期別越晚,腫瘤分化程度較高的情況下,Thsd7a的表達率越高;(4)Thsd7a的表達量與預后沒有顯著相關(guān)性,但臨床分期、T分期和N分期以及分化程度與哈薩克族食管鱗癌患者的預后相關(guān)。COX多因素分析顯示臨床分期和T/N分期,是預后的獨立危險因素。第二部分:(1)敲減Thsd7a后,MTT實驗顯示EC 9706和Eca 109的增殖活性均顯著受到了抑制;細胞劃痕和transwell遷移實驗顯示,EC 9706和Eca 109細胞的遷移能力受到了顯著的抑制;侵襲實驗顯示,EC 9706和Eca 109細胞株的侵襲能力在敲減Thsd7a后受到了顯著的抑制,說明了目的基因能夠分泌金屬蛋白酶,具有較強侵襲能力;流式細胞術(shù)檢測發(fā)現(xiàn),敲減Thsd7a能夠使得細胞周期阻滯在G0/G1期,且細胞凋亡率明顯增加;(2)裸鼠成瘤實驗顯示,敲減Thsd7a能夠有效的抑制Eca 109細胞在裸鼠體內(nèi)的成瘤能力;(3)采用微陣列基因芯片檢測Thsd7a敲減后Eca 109細胞中mRNA表達水平發(fā)生顯著差異的基因和信號通路。進一步RT-PCR驗證后,發(fā)現(xiàn)Thsd7a與五個經(jīng)典通路顯著相關(guān),分別為:mTOR通路、Cell Cycle G1/S Checkpoint通路、Wnt通路、AMPK通路和ERK/MAPK通路。第三部分:(1)采用生物信息學的方法分析基因芯片對應的實驗結(jié)果:首先在PUBMED進行基因已發(fā)表文章的篩選,入選標準為報道數(shù)量少于100篇,在腫瘤中研究比較少,且在食管癌中沒有報道過的基因。通過以上的篩選條件,挑選出37個候選基因;(2)將anti-Thsd7a shRNA轉(zhuǎn)染到Eca 109細胞實現(xiàn)Thsd7a基因的穩(wěn)定敲減,從而觀察體外細胞水平Thsd7a顯著相關(guān)的下游基因。結(jié)果發(fā)現(xiàn),其中11個基因下調(diào)顯著(40%),因此對這11個基因進行功能學篩選。(3)對目的基因逐一設計3個干擾靶點進行混合,并轉(zhuǎn)染到Eca 109細胞。通過Celigo儀高通量實時檢測的方法,結(jié)果發(fā)現(xiàn)2個基因(SCARA5和SMCO4)能夠顯著影響食管鱗癌細胞增殖能力。并進一步通過單靶點Celigo驗證的方法,證實并明確了敲減效率顯著的干擾序列shSCARA5(PSC38272)和shSMCO4(PSC37528)。(4)SCARA5在食管癌細胞系的本底表達檢測顯示,SCARA5在Eca 109和EC 9706細胞中表現(xiàn)為高表達,在TE-1細胞中表現(xiàn)為低表達。(5)敲減SCARA5后,MTT實驗顯示體外食管癌細胞系Eca 109的增殖活性受到了顯著抑制;細胞克隆形成實驗顯示,Eca 109的細胞克隆形成能力受到顯著抑制;細胞劃痕和transwell遷移實驗顯示,Eca 109細胞的遷移能力受到了顯著的抑制;流式細胞術(shù)檢測發(fā)現(xiàn),敲減SCARA5能夠使得細胞周期阻滯在S期和G2/M期,且細胞凋亡率明顯增加。(6)外顯子測序結(jié)果顯示,SCARA5表現(xiàn)為促癌功能可能是因為該基因5號外顯子的第30位基因序列出現(xiàn)CT錯義突變(C/G)引起的。結(jié)論:(1)免疫組化實驗檢測Thsd7a在維吾爾族、哈薩克族、漢族和蒙古族食管鱗癌和癌旁組織的表達情況。結(jié)果顯示,Thsd7a在維吾爾族、漢族和蒙古族的食管癌患者癌和癌旁表達差異不顯著,而在哈薩克族食管鱗癌和癌旁正常組織表達差異顯著;(2)Thsd7a在哈薩克族食管鱗癌組織中表達顯著,且Thsd7a表達與食管癌患者分化程度、臨床分期顯著相關(guān);(3)Thsd7a能抑制食管鱗癌細胞的凋亡,影響細胞周期,促進癌細胞的增殖、遷移。在裸鼠移植瘤實驗中,Thsd7a在體內(nèi)能夠促進食管癌細胞生長,發(fā)揮著癌基因的作用;(4)Thsd7a發(fā)揮功能需要通過5個經(jīng)典腫瘤相關(guān)通路來完成。而且Thsd7a下游驅(qū)動基因SCARA5,在食管癌細胞中同樣發(fā)揮促癌的功能;(5)通過食管癌細胞的外顯子測序發(fā)現(xiàn),抑癌基因SCARA5在食管癌細胞系中表現(xiàn)促癌功能,可能主要源于外顯子突變特別是5號外顯子的CT錯義突變。本研究為食管癌的靶向治療提供了新的靶點和思路。
【圖文】：

第一部分·結(jié) 果達情況白在正常食管粘膜上皮散在分布，定位于細胞膜呈黃色陽性細胞多呈巢形或灶形分布（見圖1-1）。100例維吾爾古族ESCC組織中Thsd7a蛋白陽性表達率分別為35.0%（3527.3%（3/11），87例維吾爾族、94例漢族和9例蒙古族癌性表達率分別為29.9%（26/87）、19.2%（18/94）和33.3%和蒙古族正常食管組織Thsd7a蛋白陽性率與ESCC組織相似.05，，表1)。117例哈薩克族ESCC組織中Thsd7a蛋白陽性表111例正常食管組織中Thsd7a陽性表達率為18.0%（20/111照組織Thsd7a蛋白陽性率明顯低于ESCC組織,差異有1-3)。組織化學檢測Thsd7a在各民族正常食管和ESC

G：食管鱗癌組織（×200） H：食管鱗癌組織（×400）G：ESCC tissues（×200） H：ESCC tissues（×400）圖1-2 Thsd7a在哈薩克族食管鱗癌及癌旁正常食管組織中的表達Fig. 1-2 The expression of Thsd7a in Kazakh’s ESCC and adjacent normal tissuesa
【學位授予單位】：新疆醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R735.1


本文編號：2595114