【摘要】：半乳糖苷酶是降解蜜二糖、乳糖和棉籽糖等含有半乳糖苷鍵的糖苷水解酶,該酶在食品、醫(yī)療和飼料等行業(yè)具有重要的應用。特殊環(huán)境來源的微生物有環(huán)境適應性,其產生的半乳糖苷酶具有潛在的特殊性質。本課題從鹽堿湖、紅樹林和火焰山分離菌中克隆得到4個半乳糖苷酶基因,其中3個半乳糖苷酶基因在大腸桿菌或酵母中得到異源表達,同時對表達的重組半乳糖苷酶進行純化和酶學性質研究。主要內容如下:1、以豆粕或乳糖為唯一碳源的篩選培養(yǎng)基,從鹽堿湖、紅樹林和火焰山分離菌篩選到7株產半乳糖苷酶微生物。利用簡并引物從3株產酶微生物克隆到4個半乳糖苷酶基因片段,這些片段的氨基酸序列與已知半乳糖苷酶的最高一致性在74%～100%。2、采用TAIL-PCR或同源克隆的方法獲得4個半乳糖苷酶基因的全長,設計特異性引物,PCR擴增4個半乳糖苷酶基因,并進行生物信息學分析:半乳糖苷酶基因agalSL3-GH27、bgalSL3-GH42、agalMF5-GH27和bgalFM3-GH2的長度分別為1167、2058、1311和3045 bp,分別編碼388、685、436和1014個氨基酸酸,與已知半乳糖苷酶蛋白最高一致性分別為99%、97%、99%和71%。3、純化的重組僅-半乳糖苷酶rAgalSL3-GH27主要酶學性質:最適反應pH是5.5,在pH 5.0～10.0有很好的穩(wěn)定性;最適反應溫度55。℃C,在55℃以下保持好的熱穩(wěn)定性;在低于1.5 mol·L-1的NaCl溶液中,重組酶基本不受影響;在3 mol·L-1的NaCl和KCl溶液中有很好的穩(wěn)定性;水解PNPG的比活、Km、Vmax和Kcat分別為379.78 ±5.80 U·mg-1、2.61±0.02 μmol·mL-1、452.30±0.57μmol·(mg·min)-1和345.53 ±1.27 s-1;該酶可水解蜜二糖和棉籽糖,不能水解ONPG和瓜爾豆膠4、純化的重組β-半乳糖苷酶rBgalSL3-GH42主要酶學性質:最適反應pH為6.5,在pH 6.0～9.0保持好的穩(wěn)定性;最適反應溫度40℃,在40℃以下保持穩(wěn)定;NaCl對重組酶的影響較小,在1.5 mol·L-1的NaCl溶液中有較好的穩(wěn)定性;重組酶水解ONPG的比活、Km、Vmax和Kcat 分別為354.48 ±7.68 U·mg-1、10.76±0.38μmoL·mL-1、833.33±1.21 μmol·(mg·min)-1和1110.42±1.36 s-1;重組酶水解乳糖,不能水解PNPG。5、純化的重組α-半乳糖苷酶rAgalMF5-GH27主要酶學性質:最適反應pH是4.5,在pH 4.0～8.0有較好的穩(wěn)定性;最適反應溫度為50℃C,在50℃以下保持較好的穩(wěn)定性;水解PNPG的比活、Km、Vmx，

本文編號：2589935