【摘要】：磷在植物生長(zhǎng)發(fā)育中起著關(guān)鍵的作用,大量營(yíng)養(yǎng)元素中磷的缺少會(huì)影響到植物生長(zhǎng)的各個(gè)環(huán)節(jié)。磷素在土壤中的含量很多但是可利用的卻很少,為了應(yīng)對(duì)這些環(huán)境條件的制約,植物進(jìn)化出了自己的磷素利用系統(tǒng)。磷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白PHT1家族對(duì)磷的吸收和利用起到了關(guān)鍵作用,在磷脅迫的條件下,大多數(shù)的磷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因都進(jìn)行了大量表達(dá)來(lái)提高細(xì)胞體內(nèi)的磷素含量。番茄(Solanum lycopersicum)是主要蔬菜栽培作物,缺磷可引起番茄的產(chǎn)量和品質(zhì)下降,研究番茄高親和磷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白SlPT1基因的功能可以幫助解決番茄對(duì)磷素的利用。本課題構(gòu)建了SlPT1基因的過(guò)表達(dá)載體對(duì)擬南芥突變體進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化,驗(yàn)證其在擬南芥突變體中的功能。對(duì)SlPT1基因啟動(dòng)子進(jìn)行了克隆,并對(duì)其特性進(jìn)行初步研究。具體實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下:1.通過(guò)NCBI在線查找番茄基因數(shù)據(jù)庫(kù),獲得了番茄SlPT1基因的序列,分析定位開(kāi)放閱讀框并進(jìn)行設(shè)計(jì)引物,PCR擴(kuò)增獲得了一條長(zhǎng)為1654bp的片段序列。通過(guò)Blast基因序列比對(duì)與氨基酸序列比對(duì)進(jìn)行分析,番茄磷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因SlPT1的全長(zhǎng)為2002bp(GenBank ACCESSION NM_001247432),開(kāi)放閱讀框?yàn)?617bp,編碼一個(gè)538個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)。番茄SlPT1基因編碼的磷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的分子式為:C_(2716)H_(4137)N_(673)O_(722)S_(29)。氨基酸的組成成分表2.6,分子量:58699.54D,等電點(diǎn)為8.51,平均親水系數(shù)0.401,不穩(wěn)定系數(shù)29.20。番茄SlPT1與擬南芥AtPT4有高同源性。2.將擴(kuò)增克隆得到的SlPT1基因連接到T-Vector pMD 19載體上并轉(zhuǎn)化大腸桿菌,然后進(jìn)行測(cè)序。將測(cè)序正確的提取質(zhì)粒,SlPT1-T質(zhì)粒和pCAMBIA3301/Luc載體質(zhì)粒用分別用XbaⅠ和XmaⅠ限制性內(nèi)切酶進(jìn)行處理,然后進(jìn)行連接轉(zhuǎn)化,將構(gòu)建的表達(dá)載體命名為SlPT1-pCAMBIA3301/Luc。3.用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的蘸花法進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化擬南芥突變體,篩選并獲得了轉(zhuǎn)基因植株,進(jìn)而獲得T1代種子。進(jìn)而對(duì)T1代植株進(jìn)行表型觀察,相比于對(duì)照植株,轉(zhuǎn)基因植株在正常培養(yǎng)條件下未出現(xiàn)缺磷癥狀差異不明顯,但是根部形態(tài)變化明顯。轉(zhuǎn)基因植株提高了磷的吸收,在正常培養(yǎng)條件下高于對(duì)照,缺磷情況下和對(duì)照相比不明顯。4.擴(kuò)增獲得了一條903bp大小的啟動(dòng)子序列,在線進(jìn)行序列分析和順式作用元件預(yù)測(cè)。將克隆得到的片段連接T-Vector pMD 19載體測(cè)序,將SlPT1-Pro-T質(zhì)粒和pBI121載體質(zhì)粒用酶切位點(diǎn)HindⅢ到XmaⅠ進(jìn)行雙酶切,連接轉(zhuǎn)化并驗(yàn)證,構(gòu)建完成替換CaMV35S啟動(dòng)子的表達(dá)載體。通過(guò)對(duì)擬南芥的瞬時(shí)表達(dá),根據(jù)對(duì)照比較及其染色效果分析,SlPT1基因啟動(dòng)子在根部活性明顯。綜上所述:構(gòu)建完成了表達(dá)載體SlPT1-pCAMBIA3301/Luc。對(duì)轉(zhuǎn)基因植株處理,進(jìn)行表型觀察,相比于對(duì)照植株轉(zhuǎn)基因植株在正常培養(yǎng)條件下未出現(xiàn)缺磷癥狀差異不明顯但是根部形態(tài)變化明顯。轉(zhuǎn)基因植株提高了磷的吸收,在正常培養(yǎng)條件下高于對(duì)照,缺磷情況下和對(duì)照相比不明顯。SlPT1基因啟動(dòng)子對(duì)擬南芥的轉(zhuǎn)化,進(jìn)行了初步研究,SlPT1基因啟動(dòng)子在根部活性明顯。
【圖文】：

驟：5℃2 min4℃30 s60℃30 s 共 30 個(gè)循環(huán)72℃2 min72℃5 min 4℃+∞泳檢測(cè)確認(rèn)。將條帶正確的菌液，，吸取 3余菌液加無(wú)菌的甘油放入-80℃保存。 為模板，利用特異性引物擴(kuò)增 SlPT1 基，與預(yù)期片段大小相符（圖 2.1）。

圖 2.2 T- Vector pMD 19 質(zhì)粒圖譜Fig. 2.2 T- Vector pMD 19 plasmid map圖 2.3 轉(zhuǎn)化大腸桿菌藍(lán)白斑篩選Fig. 2.3 Transform E. coli blue and white spot screening
【學(xué)位授予單位】：沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類(lèi)號(hào)】：S641.2

【參考文獻(xiàn)】

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1 劉于;孔玉珠;劉慧麗;莫肖蓉;;轉(zhuǎn)基因改良水稻磷吸收效率的策略[J];植物生理學(xué)報(bào);2015年08期

2 蘇順宗;吳鋒鍇;劉丹;吳玲;高世斌;;一個(gè)玉米Pht1家族磷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因克隆和功能分析[J];核農(nóng)學(xué)報(bào);2013年07期

3 丁廣大;陳水森;石磊;蔡紅梅;葉祥盛;;植物耐低磷脅迫的遺傳調(diào)控機(jī)理研究進(jìn)展[J];植物營(yíng)養(yǎng)與肥料學(xué)報(bào);2013年03期

4 劉芳朋;張立軍;谷俊濤;李小娟;郭程謹(jǐn);路文靜;肖凱;;小麥磷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因TaPT4的克隆和表達(dá)分析[J];河北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào);2012年03期

5 杜娟;崔瑞峰;王春枝;;不同施肥處理對(duì)番茄品質(zhì)的影響[J];上海蔬菜;2011年03期

6 張樹(shù)華;趙芳華;崔喜榮;郭程謹(jǐn);肖凱;;小麥磷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因TaPT2的轉(zhuǎn)錄調(diào)控特征研究[J];河北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào);2011年02期

7 高佳;劉雄倫;劉玲;戴良英;;水稻磷酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Pht1家族研究進(jìn)展[J];中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào);2009年15期

8 楊存義;劉靈;沈宏;嚴(yán)小龍;;植物Pht1家族磷轉(zhuǎn)運(yùn)子的分子生物學(xué)研究進(jìn)展[J];分子植物育種;2006年02期

9 常勝合,舒海燕,童一平,秦廣雍,李濱,李振聲;兩個(gè)小麥磷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的分離、功能鑒定和表達(dá)研究(英文)[J];西北植物學(xué)報(bào);2004年10期

本文編號(hào)：2589759