【摘要】：魚(yú)類(lèi)作為變溫動(dòng)物,溫度是魚(yú)類(lèi)生存過(guò)程中最重要的環(huán)境因素之一,它不僅決定了魚(yú)類(lèi)的分布,且直接和間接的影響著魚(yú)類(lèi)的生理功能和行為。在細(xì)胞和分子水平,低溫不僅會(huì)大大降低酶促反應(yīng)和體內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)速率,還會(huì)誘導(dǎo)蛋白質(zhì)變性、抑制轉(zhuǎn)錄和翻譯、破壞細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)和改變細(xì)胞膜通透性等,此外,冷應(yīng)激還會(huì)改變細(xì)胞脂雙層的特性,包括相變和脂肪酸組成。魚(yú)類(lèi)的鰓組織直接暴露于外環(huán)境中是魚(yú)類(lèi)感知外部環(huán)境壓力的第一個(gè)器官。鰓對(duì)魚(yú)類(lèi)適應(yīng)外部環(huán)境溫度的變化和調(diào)節(jié)體內(nèi)生理反應(yīng)起到至關(guān)重要的作用。本實(shí)驗(yàn)前期運(yùn)用CRISPR/CAS9技術(shù)分別敲除斑馬魚(yú)的bmp10(bone morphogenetic protein 10,bmp10)和dusp1(dual-specificity phosphatase 1,dusp1)基因,發(fā)現(xiàn)bmp10和dusp1在低溫環(huán)境下對(duì)斑馬魚(yú)的鰓組織凋亡有明顯的調(diào)控作用,但引起凋亡的分子機(jī)制仍不清楚。Bmp10屬于TGF-β超家族成員,已有研究證明bmp10在小鼠心臟發(fā)育過(guò)程中具有重要作用,但在斑馬魚(yú)的研究中還缺乏相關(guān)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)室前期運(yùn)用CRISPR/CAS9技術(shù)敲除斑馬魚(yú)bmp10基因,成功獲得能穩(wěn)定遺傳的F2代,研究發(fā)現(xiàn)低溫環(huán)境下bmp10在魚(yú)類(lèi)鰓組織細(xì)胞凋亡過(guò)程中起著重要的調(diào)控作用。但其具體的分子調(diào)控機(jī)制還不清楚。因此,本研究以前期獲得的bmp10~(-/-)純合突變體斑馬魚(yú)為研究對(duì)象,發(fā)現(xiàn)與野生型斑馬魚(yú)相比,bmp10~(-/-)純合突變體斑馬魚(yú)在低溫環(huán)境下P53蛋白表達(dá)水平明顯增加。同時(shí)bmp10~(-/-)純合突變體斑馬魚(yú)在低溫環(huán)境下P53及其靶基因的mRNA表達(dá)水平會(huì)迅速升高,鰓組織發(fā)生凋亡產(chǎn)生嚴(yán)重?fù)p傷,加快bmp10~(-/-)純合突變體斑馬魚(yú)的死亡。雙特異性磷酸酶-1(DUSP1/MKP1)作為蘇氨酸-酪氨酸雙特異性磷酸酶家族的成員,最初在培養(yǎng)的鼠科細(xì)胞中被發(fā)現(xiàn)。先前的研究表明,dusp1是通過(guò)介導(dǎo)細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白激酶的去磷酸化作用行使功能。且在細(xì)胞的增殖,分化和凋亡過(guò)程中具有重要的調(diào)控作用,本實(shí)驗(yàn)室前期的研究發(fā)現(xiàn)dusp1~(-/-)純合突變體斑馬魚(yú)在低溫環(huán)境下鰓組織細(xì)胞的凋亡明顯增加,但引起鰓組織發(fā)生凋亡的相關(guān)分子調(diào)控機(jī)制尚不清楚,本研究通過(guò)對(duì)前期獲得的dusp1~(-/-)純合突變體斑馬魚(yú)蛋白水平的檢測(cè)發(fā)現(xiàn),dusp1~(-/-)純合突變體斑馬魚(yú)在低溫環(huán)境會(huì)導(dǎo)致鰓組織細(xì)胞凋亡顯著增加,主要是由于MAPK通路中的P38和ERK的磷酸化水平增加,從而加快了鰓組織細(xì)胞凋亡,導(dǎo)致鰓組織產(chǎn)生損傷。Gsdf是TGF-β超家族的一個(gè)特異成員,主要在硬骨魚(yú)類(lèi)雄性性腺中表達(dá),但在精巢發(fā)育過(guò)程中的具體分子調(diào)控機(jī)制尚未清楚。因此,本研究以斑馬魚(yú)為研究對(duì)象,構(gòu)建了以小鼠gamma-crystalin啟動(dòng)子啟動(dòng)的Tg(Crystal-pro-gsdf-2A-egfp)熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒,采用顯微注射技術(shù)注射Tg(Crystal-pro-gsdf-2A-egfp)質(zhì)粒至1細(xì)胞期的斑馬魚(yú)受精胚胎中。在倒置熒光顯微鏡下觀察和篩選,最終獲得19條能夠在斑馬魚(yú)眼部晶狀體特異性表達(dá)綠色熒光蛋白(green fluorescent protein,GFP)的嵌合體F0代,然后將表達(dá)了綠色熒光蛋白的斑馬魚(yú)同野生型(WT)非轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)雜交,最終獲得能穩(wěn)定遺傳和表達(dá)綠色熒光蛋白的F2代。綜上所述,本研究主要揭示了斑馬魚(yú)bmp10和dusp1在低溫應(yīng)激過(guò)程中鰓組織細(xì)胞凋亡調(diào)控的相關(guān)分子機(jī)制,為研究低溫對(duì)魚(yú)類(lèi)生長(zhǎng)發(fā)育的影響提供了重要的理論依據(jù)。同時(shí),成功建立了Tg(Crystal-pro-gsdf-2A-egfp)斑馬魚(yú)轉(zhuǎn)基因品系,為觀察和研究gsdf在精巢發(fā)育過(guò)程和分子調(diào)控機(jī)制方面的作用提供了新的方法�？傊�,研究在低溫環(huán)境中的相關(guān)基因?qū)Π唏R魚(yú)正常生長(zhǎng)發(fā)育的影響和性別關(guān)鍵基因在斑馬魚(yú)雌雄分化過(guò)程中的功能作用,對(duì)了解魚(yú)類(lèi)適應(yīng)寒冷進(jìn)化和魚(yú)類(lèi)性別分化等都有重要的科學(xué)意義,同時(shí)也為培育抗寒抗凍新種和全雄經(jīng)濟(jì)魚(yú)類(lèi)奠定了重要的生物學(xué)基礎(chǔ)。
【圖文】：

實(shí)驗(yàn)室先前運(yùn)用 CRISPR/CAS9 技術(shù)分別敲除斑馬魚(yú)的 bmp10 和 dusp1 基發(fā)現(xiàn)在低溫環(huán)境處理下，bmp10-/-純合突變體和 dusp1-/-純合突變體斑馬魚(yú)與野型斑馬魚(yú)鰓組織的凋亡相比均出現(xiàn)顯著的差異，如圖（2-2）和圖（2-3）所示，低溫處理 6h 后，bmp10-/-純合突變體和 dusp1-/-純合突變體斑馬魚(yú)鰓組織的細(xì)胞亡數(shù)均顯著大于野生型斑馬魚(yú)鰓組織細(xì)胞凋亡數(shù)目，而在 28℃條件下，bmp純合突變體和 dusp1-/-純合突變體斑馬魚(yú)與野生型斑馬魚(yú)鰓組織細(xì)胞凋亡數(shù)目無(wú)顯著性的差異。因此推測(cè) bmp10 和 dusp1 可能參與斑馬魚(yú)低溫應(yīng)激過(guò)程，低環(huán)境下 bmp10 和 dusp1 的缺失促使斑馬魚(yú)鰓組織細(xì)胞凋亡明顯增加，通過(guò) H色法觀察鰓絲的病理變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，bmp10-/-純合突變體斑馬魚(yú)在常溫下，鰓片的基部有輕微的水腫現(xiàn)象，而在經(jīng)過(guò)低溫后，bmp10-/-純合突變體斑馬魚(yú)與野型斑馬魚(yú)相比鰓小片發(fā)生更加明顯的水腫，并且鰓組織上皮細(xì)胞出現(xiàn)缺失，紅胞減少，，最終阻礙氧氣的運(yùn)輸而導(dǎo)致死亡，這些現(xiàn)象表明 bmp10 在低溫環(huán)境下斑馬魚(yú)的鰓組織具有保護(hù)作用。

上海海洋大學(xué)碩士學(xué)位論文圖2-3 dusp1-/-純合突變體和野生型在28℃和8℃6h鰓組織細(xì)胞凋亡檢測(cè)結(jié)果Fig.2-3 Apoptosis results of dusp1-/-homozygous mutant and wild type at 28°C and 8°C for6 h同時(shí)用HE染色法檢測(cè)分析bmp10-/-純合突變體斑馬魚(yú)與野生型斑馬魚(yú)心臟的病理變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，bmp10-/-純合突變體斑馬魚(yú)與野生型斑馬魚(yú)相比心肌細(xì)胞排列出現(xiàn)明顯的紊亂，且心肌細(xì)胞的數(shù)目顯著減少，8℃低溫處理 6h 后發(fā)現(xiàn) bmp10-/-純合突變體斑馬魚(yú)心肌細(xì)胞減少更明顯，而野生型斑馬魚(yú)無(wú)論是在 28℃還是 8℃心肌細(xì)胞均排列整齊致密無(wú)顯著性的差異和變化，因此得出結(jié)論斑馬魚(yú) bmp10 的缺失致使心臟心肌細(xì)胞數(shù)目顯著減少，表明 bmp10 對(duì)斑馬魚(yú)的心臟發(fā)育至關(guān)重要（圖 2-4）。但 bmp10 的缺失引起這些變化的具體分子調(diào)控機(jī)制仍不清楚。
【學(xué)位授予單位】：上海海洋大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類(lèi)號(hào)】：S917.4

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本文編號(hào)：2589557