【摘要】：魚類作為變溫動物,溫度是魚類生存過程中最重要的環(huán)境因素之一,它不僅決定了魚類的分布,且直接和間接的影響著魚類的生理功能和行為。在細胞和分子水平,低溫不僅會大大降低酶促反應和體內轉運速率,還會誘導蛋白質變性、抑制轉錄和翻譯、破壞細胞骨架結構和改變細胞膜通透性等,此外,冷應激還會改變細胞脂雙層的特性,包括相變和脂肪酸組成。魚類的鰓組織直接暴露于外環(huán)境中是魚類感知外部環(huán)境壓力的第一個器官。鰓對魚類適應外部環(huán)境溫度的變化和調節(jié)體內生理反應起到至關重要的作用。本實驗前期運用CRISPR/CAS9技術分別敲除斑馬魚的bmp10(bone morphogenetic protein 10,bmp10)和dusp1(dual-specificity phosphatase 1,dusp1)基因,發(fā)現(xiàn)bmp10和dusp1在低溫環(huán)境下對斑馬魚的鰓組織凋亡有明顯的調控作用,但引起凋亡的分子機制仍不清楚。Bmp10屬于TGF-β超家族成員,已有研究證明bmp10在小鼠心臟發(fā)育過程中具有重要作用,但在斑馬魚的研究中還缺乏相關報道。本實驗室前期運用CRISPR/CAS9技術敲除斑馬魚bmp10基因,成功獲得能穩(wěn)定遺傳的F2代,研究發(fā)現(xiàn)低溫環(huán)境下bmp10在魚類鰓組織細胞凋亡過程中起著重要的調控作用。但其具體的分子調控機制還不清楚。因此,本研究以前期獲得的bmp10~(-/-)純合突變體斑馬魚為研究對象,發(fā)現(xiàn)與野生型斑馬魚相比,bmp10~(-/-)純合突變體斑馬魚在低溫環(huán)境下P53蛋白表達水平明顯增加。同時bmp10~(-/-)純合突變體斑馬魚在低溫環(huán)境下P53及其靶基因的mRNA表達水平會迅速升高,鰓組織發(fā)生凋亡產生嚴重損傷,加快bmp10~(-/-)純合突變體斑馬魚的死亡。雙特異性磷酸酶-1(DUSP1/MKP1)作為蘇氨酸-酪氨酸雙特異性磷酸酶家族的成員,最初在培養(yǎng)的鼠科細胞中被發(fā)現(xiàn)。先前的研究表明,dusp1是通過介導細胞外信號調節(jié)蛋白激酶的去磷酸化作用行使功能。且在細胞的增殖,分化和凋亡過程中具有重要的調控作用,本實驗室前期的研究發(fā)現(xiàn)dusp1~(-/-)純合突變體斑馬魚在低溫環(huán)境下鰓組織細胞的凋亡明顯增加,但引起鰓組織發(fā)生凋亡的相關分子調控機制尚不清楚,本研究通過對前期獲得的dusp1~(-/-)純合突變體斑馬魚蛋白水平的檢測發(fā)現(xiàn),dusp1~(-/-)純合突變體斑馬魚在低溫環(huán)境會導致鰓組織細胞凋亡顯著增加,主要是由于MAPK通路中的P38和ERK的磷酸化水平增加,從而加快了鰓組織細胞凋亡,導致鰓組織產生損傷。Gsdf是TGF-β超家族的一個特異成員,主要在硬骨魚類雄性性腺中表達,但在精巢發(fā)育過程中的具體分子調控機制尚未清楚。因此,本研究以斑馬魚為研究對象,構建了以小鼠gamma-crystalin啟動子啟動的Tg(Crystal-pro-gsdf-2A-egfp)熒光素酶報告質粒,采用顯微注射技術注射Tg(Crystal-pro-gsdf-2A-egfp)質粒至1細胞期的斑馬魚受精胚胎中。在倒置熒光顯微鏡下觀察和篩選,最終獲得19條能夠在斑馬魚眼部晶狀體特異性表達綠色熒光蛋白(green fluorescent protein,GFP)的嵌合體F0代,然后將表達了綠色熒光蛋白的斑馬魚同野生型(WT)非轉基因斑馬魚雜交,最終獲得能穩(wěn)定遺傳和表達綠色熒光蛋白的F2代。綜上所述,本研究主要揭示了斑馬魚bmp10和dusp1在低溫應激過程中鰓組織細胞凋亡調控的相關分子機制,為研究低溫對魚類生長發(fā)育的影響提供了重要的理論依據。同時,成功建立了Tg(Crystal-pro-gsdf-2A-egfp)斑馬魚轉基因品系,為觀察和研究gsdf在精巢發(fā)育過程和分子調控機制方面的作用提供了新的方法�？傊�,研究在低溫環(huán)境中的相關基因對斑馬魚正常生長發(fā)育的影響和性別關鍵基因在斑馬魚雌雄分化過程中的功能作用,對了解魚類適應寒冷進化和魚類性別分化等都有重要的科學意義,同時也為培育抗寒抗凍新種和全雄經濟魚類奠定了重要的生物學基礎。
【圖文】：

實驗室先前運用 CRISPR/CAS9 技術分別敲除斑馬魚的 bmp10 和 dusp1 基發(fā)現(xiàn)在低溫環(huán)境處理下，bmp10-/-純合突變體和 dusp1-/-純合突變體斑馬魚與野型斑馬魚鰓組織的凋亡相比均出現(xiàn)顯著的差異，如圖（2-2）和圖（2-3）所示，低溫處理 6h 后，bmp10-/-純合突變體和 dusp1-/-純合突變體斑馬魚鰓組織的細胞亡數(shù)均顯著大于野生型斑馬魚鰓組織細胞凋亡數(shù)目，而在 28℃條件下，bmp純合突變體和 dusp1-/-純合突變體斑馬魚與野生型斑馬魚鰓組織細胞凋亡數(shù)目無顯著性的差異。因此推測 bmp10 和 dusp1 可能參與斑馬魚低溫應激過程，低環(huán)境下 bmp10 和 dusp1 的缺失促使斑馬魚鰓組織細胞凋亡明顯增加，通過 H色法觀察鰓絲的病理變化。結果發(fā)現(xiàn)，bmp10-/-純合突變體斑馬魚在常溫下，鰓片的基部有輕微的水腫現(xiàn)象，而在經過低溫后，bmp10-/-純合突變體斑馬魚與野型斑馬魚相比鰓小片發(fā)生更加明顯的水腫，并且鰓組織上皮細胞出現(xiàn)缺失，紅胞減少，，最終阻礙氧氣的運輸而導致死亡，這些現(xiàn)象表明 bmp10 在低溫環(huán)境下斑馬魚的鰓組織具有保護作用。

上海海洋大學碩士學位論文圖2-3 dusp1-/-純合突變體和野生型在28℃和8℃6h鰓組織細胞凋亡檢測結果Fig.2-3 Apoptosis results of dusp1-/-homozygous mutant and wild type at 28°C and 8°C for6 h同時用HE染色法檢測分析bmp10-/-純合突變體斑馬魚與野生型斑馬魚心臟的病理變化。結果發(fā)現(xiàn)，bmp10-/-純合突變體斑馬魚與野生型斑馬魚相比心肌細胞排列出現(xiàn)明顯的紊亂，且心肌細胞的數(shù)目顯著減少，8℃低溫處理 6h 后發(fā)現(xiàn) bmp10-/-純合突變體斑馬魚心肌細胞減少更明顯，而野生型斑馬魚無論是在 28℃還是 8℃心肌細胞均排列整齊致密無顯著性的差異和變化，因此得出結論斑馬魚 bmp10 的缺失致使心臟心肌細胞數(shù)目顯著減少，表明 bmp10 對斑馬魚的心臟發(fā)育至關重要（圖 2-4）。但 bmp10 的缺失引起這些變化的具體分子調控機制仍不清楚。
【學位授予單位】：上海海洋大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：S917.4

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本文編號：2589557