【摘要】：以‘荸薺’和‘東魁’楊梅果實(shí)為研究材料,利用RT-PCR和RACE技術(shù)克隆得到果糖激酶基因MrF RK2的全長(zhǎng)c DNA序列。MrF RK2全長(zhǎng)1 279 bp,ORF閱讀框全長(zhǎng)996 bp,3′端非編碼區(qū)227bp,5′端非編碼區(qū)56 bp,編碼332個(gè)氨基酸殘基。通過(guò)氨基酸序列分析發(fā)現(xiàn)Mr FRK2含有pfk B碳水化合物磷酸果糖激酶家族高度保守的1個(gè)ATP結(jié)合域和2個(gè)底物結(jié)合域;Mr FRK2與楊樹Pt FRK2相似性最高,達(dá)到85%。利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)分析基因表達(dá)的結(jié)果表明,Mr FRK2在‘東魁’楊梅果實(shí)的發(fā)育早期大量表達(dá),在成熟后期表達(dá)量下降,果實(shí)成熟初期Mr FPK2表達(dá)量‘東魁’顯著高于‘荸薺’。果實(shí)成熟期間果糖含量‘東魁’顯著高于‘荸薺’,與果實(shí)成熟期間Mr FPK2的表達(dá)量相反。這表明,MrF PK2在楊梅果實(shí)成熟期間果糖降解過(guò)程中可能起一定作用。
【圖文】：

ACE技術(shù)獲得了長(zhǎng)度約為1060bp和160bp的5′和3′端序列（圖1，B、C），將這2條序列與中間片段序列進(jìn)行拼接，獲得基因全長(zhǎng)cDNA序列，共1279bp。MrFRK2全長(zhǎng)cDNA序列包含1個(gè)ATG起始密碼子和TAG終止密碼子，其中3′端非編碼區(qū)227bp，5′端非編碼區(qū)56bp。ORF閱讀框全長(zhǎng)996bp，編碼1個(gè)含有332個(gè)氨基酸殘基的蛋白，預(yù)測(cè)的等電點(diǎn)（pI）為4.80，預(yù)測(cè)分子量為35.67kD。根據(jù)獲得的基因全長(zhǎng)cDNA序列設(shè)計(jì)全長(zhǎng)特異引物fFRK2F和fFRK2R進(jìn)行RT-PCR，得到1條長(zhǎng)1268bp（圖1，D）的片段，并通過(guò)測(cè)序驗(yàn)證與軟件拼接獲得的MrFRK2全長(zhǎng)cDNA序列一致。圖1MrFRK2的克隆電泳圖A：中間片段擴(kuò)增；B：5′-RACE擴(kuò)增；C：3′-RACE擴(kuò)增；D：cDNA全長(zhǎng)擴(kuò)增；M：DL100marker。Fig.1GelelectrophoresisofMrFRK2cDNAsA：Middlesegment；B：5′-RACEsegment；C：3′-RACEsegment；D：Full-lengthcDNA；M：DL100marker.

RK2（苜蓿Medicagotruncatula，KEH30339.1）、PtFRK2（楊樹Populustrichocarpa，XP_006372861.1）、CcFRK2（克萊門柚Citrusclementina，XP_006443006.1）、VvFRK2（葡萄Vitisvinifera，XP_002268097.1）、AcFRK2（獼猴桃Actinidiachinensis，AFO84081.1）、SlFRK2（番茄Solanumlycopersicum，NP_001233888.1）、AtFRK2（擬南芥Arabidopsisthaliana，NP_172093.1）、StFRK2（馬鈴薯Solanumtuberosum，ABB29956.1）、MdFK4（蘋果Malus×domestica，NP_001281027.1）和EjFRK2（枇杷Eriobotryajaponica，ACL01290.1），比對(duì)結(jié)果如圖2所示。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，MrFRK2氨基酸序列含有碳水化合物磷酸果糖激酶家族（pfkBfamily）高度保守功能結(jié)構(gòu)域，包括1個(gè)ATP結(jié)合域（ATPbindingdomain），，2個(gè)底物識(shí)別域（substraterecognitiondomains）以及2個(gè)蛋白磷酸化位點(diǎn)（pfkB）。圖2楊梅果實(shí)MrFRK2的氨基酸序列對(duì)比圖Fig.2AlignmentofthededucedMrFRK2aminoacidsequenceswithFRK2sfromotherplants

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