【摘要】：桐酸合成酶基因FADX是油桐(Vernicia fordii)桐酸合成的關(guān)鍵基因,專一地表達于油桐正在發(fā)育的種子中。為研究其在油桐種子發(fā)育過程中的表達特點,篩選出甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因GAPDH為內(nèi)參基因,并以此檢測FADX在油桐種仁中的表達。結(jié)果表明FADX在油桐果實發(fā)育早期處于低表達狀態(tài),至果實發(fā)育中期開始大量表達,這與油桐桐酸含量在果實發(fā)育過程中的變化規(guī)律是一致的,從一個方面證明FADX與油桐的油脂合成緊密相關(guān),有助于油桐油脂合成與調(diào)控的研究。
【圖文】：

圖1油桐總RNA提取電泳圖Figure1ElectrophoresisoftotalRNAofVerniciafordii用手段，具有靈敏度高，特異性強，操作簡單的特點，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于植物基因的表達研究領(lǐng)域。采用此技術(shù)，張麗娜等(2005)以小麥穩(wěn)定表達的肌動蛋白基因(Actin)作為對照，對與抗白粉病有關(guān)的小麥TaM-lo-A1c基因的表達進行了研究；蔣倫偉等(2012)分析了RAV基因家族在黃瓜各組織中的表達情況；張艷等(2012)采用該方法發(fā)現(xiàn)了三個水孔蛋白基因在幼苗根與糖分直接接觸時明顯上調(diào)；姚曉華等(2014)對青稞種子胚胎成熟晚期豐富蛋白(LEA)基因Hva1與青稞抗旱性的關(guān)系進行了分析。通常，RT-PCR實驗會引入內(nèi)參基因校正不同樣本和實驗條件帶來的數(shù)據(jù)差異(Bustin,2002;Andersenetal.,2004)。為保證實驗的準確性，需要選擇在樣品各種組織或發(fā)育階段均能穩(wěn)定表達的基因作為內(nèi)參基因(胡瑞波等,2009)。本研究篩選出油桐種子表達分析內(nèi)參基因GAPDH，，并以此為基礎(chǔ)研究了桐酸合成關(guān)鍵基因FADX的表達模式，有助于桐油品質(zhì)改良和油桐分子輔助育種的研究。1結(jié)果與分析1.1總RNA提取及cDNA第一鏈合成提取的油桐種仁總RNA經(jīng)凝膠電泳檢測(圖1)，可觀測到清晰的28s和18s條帶，28srRNA條帶基本為18srRNA條帶亮度的2倍，表明提取的RNA完整性好，基本沒有降解，可以用于其后的研究，另外，由于LiCl對小分子核酸尤其是tRNA的沉淀效果不好，5s的條帶基本不可見。用紫外分光光度計測量提取的RNA樣品的A230，A260，A280值，所有樣品的A260nm/A230nm均在2.0~2.4之間，A260nm/A280nm在1.7~2.0之間，表明所提RNA質(zhì)量符合要求，可以滿足后續(xù)實驗要求。反轉(zhuǎn)錄體系中RNA量均為3μg，通過調(diào)整起始RNA的量，以等量的TotalRNA反轉(zhuǎn)錄合成不同的cDNA樣品之間可

分子植物育種MolecularPlantBreeding圖24個內(nèi)參基因的RT-PCR分析注:A:瓊脂糖凝膠電泳圖;M:DNAmarker;1~5分別表示7.11,8.10,8.21,9.9以及10.30五個時間點的油桐樣品;B:QuantityOne數(shù)據(jù)分析;C:GeNorm程序數(shù)據(jù)分析表Figure2Analysisofthe4internalcontrolgenesNote:A:Agarosegelelectrophoresofthe4genes;M:DNAmarker;1~5:Thesamplecollectedin7.11,8.10,8.21,9.9and10.30;B:Analysisofthequantityonedata;C:DataforGeNormprogram步分析。GeNorm程序是專門用于RT-PCR方法選擇內(nèi)參基因的程序，可以從一系列不同功能的候選內(nèi)參基因中選擇出表達穩(wěn)定度最高的內(nèi)參基因，在內(nèi)參基因的評價和篩選方面具有重要的作用(Vandes-ompeleetal.,2002)。在本研究中，我們利用GeNorm程序計算表達穩(wěn)定度平均值(M)對4個內(nèi)參基因表達穩(wěn)定度進行了排序，最終確定了GAPDH為FADX基因在油桐種子不同發(fā)育時期RT-PCR半定量檢測的內(nèi)參基因。它是糖異生、糖酵解及光合作用碳固定循環(huán)過程中的關(guān)鍵酶，在生物進化的早期出現(xiàn)，是最為常用的內(nèi)參基因之一(董曉麗等,2009,中國畜牧獸醫(yī),36(9):83-85)。前人對油桐果實生長發(fā)育規(guī)律的研究(藺定運和倪善慶,1980,植物生理學(xué)通訊,(3):37-40;何方等,1988,中國油桐科技論文選,pp.422-426)表明，油桐脂肪酸的含量從5月底到8月中旬都是逐步上升的，只是增值幅度不大，含油量不到10%，從8月中旬開始，脂肪酸的含量開始急速上升，8月底就能達到40%。從本實驗結(jié)果可以看到，在油桐果實的發(fā)育早期(7月至8月中旬)的樣品中，F(xiàn)ADX一直維持在較低的表達水平上，但是從果實發(fā)育中期(8月中旬)開始，F(xiàn)ADX的表達顯著上升且一直保持這一水平至果實凈成熟階段(10月底)，這也從一個方面證明FADX與油桐的油脂合成緊密相關(guān)?

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