發(fā)布時間：2020-02-27 08:21

【摘要】：煙草是重要的模式植物和經(jīng)濟作物,鹽害和干旱兩種環(huán)境因子對其生長發(fā)育、產(chǎn)量和品質(zhì)都危害很大。為了提高煙草的耐鹽抗旱性,本研究利用農(nóng)桿菌介導的遺傳轉(zhuǎn)化法在煙草中過量表達了堿蓬液泡膜Na~+/H~+逆向轉(zhuǎn)運基因SsNHX1,對轉(zhuǎn)基因煙草的耐鹽及抗旱性進行表型鑒定和各項生化指標的檢測,以期得到耐鹽抗旱表性良好的SsNHX1轉(zhuǎn)基因煙草。表型分析發(fā)現(xiàn),SsNHX1基因過表達株系L1和L5的抗鹽能力比野生型顯著提高,表現(xiàn)為鹽脅迫條件下仍能保持旺盛的生長且根系的伸長未受抑制。SsNHX1過表達株系在葉片和根系中積累了更多的Na~+和K~+,同時Na~+含量增長速率較快,而K~+含量降低速率較緩,并可維持較高的葉片相對含水量和葉綠素含量,及較低的丙二醛含量和相對電導率。干旱脅迫發(fā)現(xiàn),過表達株系受干旱脅迫程度更小,并在復水后迅速恢復正常生長。同時,過表達株系的丙二醛含量和相對電導率顯著低于野生型,且維持了較高的葉片相對含水量及葉綠素含量。這些結(jié)果說明SsNHX1基因在煙草中過量表達后,降低了鹽脅迫和干旱脅迫對煙草根系及細胞膜的損傷,并通過調(diào)節(jié)離子含量、降低細胞的滲透勢,維持了葉片較高的相對含水量和葉綠素含量,最終提高了煙草的抗鹽和抗旱性。
【圖文】：

1520中國生態(tài)農(nóng)業(yè)學報2017第25卷http://www.ecoagri.ac.cn的Hoagland營養(yǎng)液處理24h,提取葉片DNA以及Trizol法提取葉片RNA。SsNHX1基因通過XbaI和SmaI酶切位點連接在植物表達載體pCPB(改自pCambia3300)的35S啟動子之后(圖1a),用于檢測轉(zhuǎn)基因植物中的SsNHX1片段的引物是tSsNHX1-F(5-AGGGAGCAAAGACAAGAG-3)和tSsNHX1-R(5-TCTTCTATCTGAGCGGAATT-3)。并使用引物qSsNHX1-F(5-GTCATTTGGTGGGCTGGTCTC-3)和qSsNHX1-R(5-TGAAAAGGACAACGGTTATGGTG-3)進行RT-PCR檢測,篩選出SsNHX1基因高表達株系。1.3鹽脅迫下SsNHX1轉(zhuǎn)基因煙草耐鹽性分析將溶液培養(yǎng)的SsNHX1轉(zhuǎn)基因株系L1和L5及野生型煙草幼苗,用0g·L1、2.5g·L1、5g·L1、7.5g·L1NaCl進行處理,每個株系3株煙草,每個鹽濃度處理重復3次,處理7d,每2d更換一次營養(yǎng)液。處理結(jié)束取樣,用根系掃描儀掃描根系,觀察煙草幼苗的生長狀況并測量根系的長度;隨后用火焰分光光度計分別測定野生型和轉(zhuǎn)基因煙草株系的根系和葉片中Na+和K+離子含量。1.4干旱脅迫下SsNHX1轉(zhuǎn)基因煙草耐旱性分析土壤培養(yǎng)的SsNHX1轉(zhuǎn)基因株系L1和L5及野生型幼苗長至9~10葉期,每個株系3株煙草,每個處理天數(shù)重復3次,進行斷水12d干旱處理后再復水3d,從每株葉片中間部分取樣,觀測其在斷水0d、3d、6d、9d、12d及復水1d、3d的生長情況。1.5鹽脅迫和干旱脅迫下SsNHX1轉(zhuǎn)基因煙草生理生化指標測定分別將鹽脅迫和干旱脅迫處理后的野生型和SsNHX1轉(zhuǎn)基因株系L1和L5煙草進行生理生化指標的鑒定,包括:相對含水量(relativewatercontent,RWC)[21]、葉綠素含量[22]、丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量[23]、相對電導率[24]。所得數(shù)據(jù)用SPSS13.0軟件分析,并用MicrosoftExcel軟件作圖。2結(jié)果與分析2.

第10期陳鑫等:轉(zhuǎn)堿蓬SsNHX1基因煙草的耐鹽抗旱性研究1521http://www.ecoagri.ac.cn的根長進行了研究。在無鹽脅迫下,兩者總根長無顯著性差異,但在鹽脅迫下,轉(zhuǎn)基因煙草L1和L5與野生型的總根長差異顯著(圖2b)。且隨著鹽處理濃度的升高,野生型的總根長明顯變短,而轉(zhuǎn)基因株系L1和L5的總根長降低幅度較小,如在7.5g·L1NaCl濃度處理下轉(zhuǎn)基因株系L1和L5根長分別是野生型煙草的2.64和2.72倍,差異顯著。說明鹽脅迫雖然都抑制著煙草根系的生長,但轉(zhuǎn)基因株系受到的抑制作用相對較輕,基本不影響其根系的生長發(fā)育。圖2鹽脅迫處理后SsNHX1轉(zhuǎn)基因煙草和野生型的表型(a)及根長(b)Fig.2Phenotype(a)androotlength(b)ofSsNHX1-transgenictobaccoplantsandwidetypeplantsaftersaltstresstreatmenta:幼苗在0g·L1、0.25g·L1、0.50g·L1和0.75g·L1的NaCl梯度濃度霍格蘭溶液中培養(yǎng),直到三葉期;b:經(jīng)過NaCl濃度梯度處理后的根長。WT為野生型煙草;L1和L5為SsNHX1煙草轉(zhuǎn)基因株系;*表示差異顯著,誤差線表示標準方差。a:seedlingswerehydratedwithHoaglandnutrientsolutionwithanincreasedNaClgradientof0g·L1,2.5g·L1,5g·L1and7.5g·L1(w/v)untilthethree-leafstage;b:rootlengthafterimmersionin0g·L1,2.5g·L1,5g·L1,and7.5g·L1NaCl.WTiswildtypetobacco;L1andL5areSsNHX1transgenictobaccolines.*indicatessignificantdifference.Valuesoferrorbararemeansstandarddeviation.2.3SsNHX1轉(zhuǎn)基因煙草在鹽脅迫條件下根系和葉片的Na+和K+含量植物體吸收過高的Na+,會導致植物體營養(yǎng)離子的失衡,特別是K+的吸收抑制和流失。在鹽脅迫條件下液泡Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白則會將Na+

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