發(fā)布時(shí)間：2020-02-26 21:22

【摘要】：長(zhǎng)期種植轉(zhuǎn)蘇云金芽孢桿菌Bacillus thuringiensis(Bt)基因作物使一些靶標(biāo)害蟲(chóng)產(chǎn)生了Bt抗性,有人研究發(fā)現(xiàn)ABCG亞家族基因中的white(ABCG1)基因表達(dá)下調(diào)能夠使小菜蛾P(guān)lutella xylostella產(chǎn)生Cry1Ac抗性,我們推測(cè)棉鈴蟲(chóng)Helicoverpa armigera的ABCG1基因(HaABCG1)表達(dá)下調(diào)可能與棉鈴蟲(chóng)對(duì)Cry1Ac毒素的抗性有關(guān),即棉鈴蟲(chóng)HaABCG1蛋白可能介導(dǎo)棉鈴蟲(chóng)Cry1Ac抗性。首先,我們克隆并分析棉鈴蟲(chóng)HaABCG1的開(kāi)放閱讀框(open reading frame,ORF);然后從棉鈴蟲(chóng)體內(nèi)和體外兩方面分別研究ABCG1基因與Cry1Ac毒素的關(guān)系,通過(guò)構(gòu)建含HaABCG1基因的表達(dá)載體檢測(cè)HaABCG1蛋白在TnH5細(xì)胞中的亞細(xì)胞定位;通過(guò)細(xì)胞毒力實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證棉鈴蟲(chóng)HaABCG1蛋白與Cry1Ac毒素的關(guān)系;利用RNAi技術(shù)驗(yàn)證棉鈴蟲(chóng)HaABCG1表達(dá)下調(diào)是否會(huì)降低棉鈴蟲(chóng)對(duì)Cry1Ac毒素的敏感性。結(jié)果發(fā)現(xiàn):1棉鈴蟲(chóng)HaABCG1基因的克隆表達(dá)及蛋白序列分析棉鈴蟲(chóng)HaABCG1基因的ORF由1 896個(gè)核苷酸組成,編碼蛋白含631個(gè)氨基酸殘基,分子質(zhì)量約69.63 kDa,等電點(diǎn)是8.76。棉鈴蟲(chóng)HaABCG1蛋白沒(méi)有信號(hào)肽和O-糖基化位點(diǎn),有4個(gè)N-糖基化位點(diǎn),一個(gè)細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)核酸結(jié)合域(nucleotide binding domain,NBD),一個(gè)含有6個(gè)α-螺旋的跨膜區(qū)(transmembrane domain,TMD)和ABC轉(zhuǎn)運(yùn)家族的特征性標(biāo)記結(jié)構(gòu),這些均與ABCG亞家族的特征相符合。2棉鈴蟲(chóng)HaABCG1基因的進(jìn)化樹(shù)分析對(duì)來(lái)自不同物種的37條蛋白序列構(gòu)建進(jìn)化樹(shù),分析表明,ABCG家族蛋白序列和ABCA1蛋白序列能夠明顯區(qū)別開(kāi)來(lái);昆蟲(chóng)ABCG1與非昆蟲(chóng)ABCG1具有很高的相似性,與昆蟲(chóng)ABCG4蛋白序列的相似性高于ABCG5蛋白序列和ABCG8蛋白序列。3 HaABCG1-GFP融合蛋白的亞細(xì)胞定位以及HaABCG1介導(dǎo)Bt毒素穿孔的細(xì)胞毒力功能驗(yàn)證構(gòu)建帶有GFP標(biāo)簽的棉鈴蟲(chóng)真核表達(dá)質(zhì)粒pEGFP-N1/HaABCG1,HaABCG1-GFP融合蛋白在TnH5細(xì)胞內(nèi)表達(dá),借助熒光顯微鏡觀察其在細(xì)胞中的定位,HaABCG1主要分布在TnH5細(xì)胞的核膜和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上。HaABCG1-GFP融合蛋白在TnH5昆蟲(chóng)細(xì)胞表達(dá)24 h后,當(dāng)處理細(xì)胞的Cry1Ac,Cry2Aa,Cry1Ca和Cry1Fa這4種毒素處理1 h后,TnH5細(xì)胞同陰性對(duì)照一樣幾乎沒(méi)有發(fā)生病變,而表達(dá)HaABCC2-GFP和HaCad-GFP的陽(yáng)性對(duì)照細(xì)胞膨脹破裂,即HaABCG1不是Cry1Ac,Cry2Aa,Cry1Ca和Cry1Fa 4種毒素的受體。4基于RNAi和生物測(cè)定的棉鈴蟲(chóng)HaABCG1基因功能驗(yàn)證干擾72 h后,一部分棉鈴蟲(chóng)幼蟲(chóng)用于提取RNA,反轉(zhuǎn)錄并進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量;另一部分幼蟲(chóng)用于生物測(cè)定實(shí)驗(yàn),在含0.05μg/mL Cry1Ac的飼料上飼養(yǎng)3 d。對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組者的死亡率沒(méi)有顯著性差異;在干擾效率高于40%時(shí),對(duì)照組和處理組幼蟲(chóng)的體重都有所下降,對(duì)照組注射無(wú)RNase水的幼蟲(chóng)體重的減少量大于注射siABCG1的;通過(guò)方差分析結(jié)果看出,對(duì)照組和處理組幼蟲(chóng)的體重變化沒(méi)有顯著性差異。通過(guò)體內(nèi)和體外兩個(gè)方面的實(shí)驗(yàn)我們總結(jié)出,棉鈴蟲(chóng)HaABCG1基因的表達(dá)下調(diào)與棉鈴蟲(chóng)對(duì)Cry1Ac的抗性不相關(guān),棉鈴蟲(chóng)的HaABCG1不是Cry1Ac毒素的受體。這是首次報(bào)道ABCG1基因不參與棉鈴蟲(chóng)的Cry1Ac抗性。
【圖文】：

圖 1 Cry 和 Cyt 毒素蛋白的三維立體結(jié)構(gòu)Fig.1 Three-dimensional structure of three-domain-Cry and Cyt proteins素有三個(gè)蛋白域。蛋白域I（灰色帶狀），由7個(gè)α-螺旋組成，結(jié)構(gòu)域II 和 III由β-折疊組成（分別是Cyt毒素僅僅有一個(gè)α-β蛋白域，α-螺旋發(fā)夾外層包圍著一個(gè)β-折疊，N-末端（白色帶狀）含有所有的端（黑色帶狀）含有一個(gè)β-折疊（Li et al., 1991）。Cry proteins are composed of three domains. Domaingrey ribbons), is abundle of seven α-helices and domains II and III (shown in white and black ribbons, respormed by β-strands. Cyt proteins are composed of a single α-βdomain. N-terminal fragment (shown in whitntains all a-helices and C-terminal fragment (shown in black ribbons) is a β-sheet composed of β-strands（1991）.Bt 毒蛋白 Cry 毒素的結(jié)構(gòu) Cry 毒素經(jīng)明確結(jié)構(gòu)組成的 Cry 毒素對(duì)鱗翅目、雙翅目、鞘翅目和線蟲(chóng)具有特殊的些毒素具有相似的結(jié)構(gòu)。隨著分子生物技術(shù)、X-射線和核磁共振（NMR革和發(fā)展，人們對(duì)蛋白結(jié)構(gòu)在原子能級(jí)的認(rèn)識(shí)和功能的認(rèn)識(shí)有了更深的理

棉鈴蟲(chóng) ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白 ABCG1 的基因克隆和功能分析連鎖（Gahan et al., 2001; Xu et al., 2005; Morin et al., 2003; Xu et al., 2014; Xie et al.;2005）。很多研究也發(fā)現(xiàn) Cadherin，APN 及 ALP 的下調(diào)表達(dá)與抗性產(chǎn)生有關(guān)（Tiewsiri &Wang, 2011; Jurat-Fuentes et al., 2011）。有研究表明某些抗性品系中 ALP 的上調(diào)表達(dá)可能與抗性產(chǎn)生有關(guān)，這可能是 ALP 從中腸細(xì)胞 BBMV 上脫落導(dǎo)致的，也可能與可溶性及錨定性 ALP 的比例變化有關(guān)系（Caccia et al., 2012）。究其變化的根源，，很可能有相關(guān)受體糖基化過(guò)程發(fā)生變化有關(guān)（Griffitts et al., 2001; Griffitts et al., 2005; Zielinska et al.,2010）。靶標(biāo)害蟲(chóng) Bt 作用機(jī)理的研究不斷取得重要突破，但仍有許多具有 Bt 抗性的種群，其抗性機(jī)理尚未闡述清楚。
【學(xué)位授予單位】：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：S433

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