【摘要】：酵母在釀酒、制藥、食品等行業(yè)的工業(yè)生產(chǎn)中有非常重要的應(yīng)用價值,同時,酵母也是真核生物研究的重要模式生物。在生產(chǎn)實踐中,酵母細胞的自溶衰亡會對產(chǎn)品的品質(zhì)造成不利影響,例如給啤酒帶來濃重的不良風味等。酵母細胞壁是維持細胞自身形態(tài)構(gòu)造、抵抗外界機械壓力和維持滲透壓的重要組成部分。β-1,3-葡聚糖是組成細胞壁的重要結(jié)構(gòu),FKS家族基因是合成β-1,3-葡聚糖合成酶的關(guān)鍵基因。為探究細胞壁β-1,3-葡聚糖對維持細胞的生理特性作用,了解酵母自溶的機理和調(diào)控因子,本文通過分子改造對FKS家族基因進行敲除,分析比較原始菌株和重組菌株的細胞壁形態(tài)、細胞壁組成成分、酵母抗自溶能力、抗環(huán)境脅迫能力和細胞壁合成相關(guān)基因表達狀況等,以此研究FKS家族基因與酵母細胞形態(tài)以及酵母抗自溶性能的關(guān)系。主要研究結(jié)果如下:(1)構(gòu)建重組菌株:以FKS1基因缺陷菌株和FKS2基因缺陷菌株為出發(fā)菌,分別以尿嘧啶和組氨酸營養(yǎng)缺陷型為篩選標記分別敲除FKS2和FKS3基因,最終得到FKS1、FKS2雙基因缺陷菌株,FKS1、FKS3雙基因缺陷菌株,FKS2、FKS3雙基因缺陷菌株和FKS1、FKS2、FKS3三基因缺陷菌株,對重組菌株分別命名為fks1,2-QT、fks1,3-QT、fks2,3-Q和fks1,2,3-QT。(2)對重組菌株細胞形態(tài)的分析:FKS1、FKS2和FKS3基因單獨敲除對酵母細胞形態(tài)沒有太大影響,而在FKS1和FKS2敲除的重組菌株,酵母形態(tài)變成橢圓形。同時,fks1,2-QT和fks1,2,3-QT的體積相對于原始菌株W303分別減小了71.26%和74.25%。因此,基因FKS1和FKS2共同作用控制酵母的細胞形態(tài)。(3)FKS家族基因?qū)湍讣毎诙嗵堑挠绊?FKS家族基因與酵母合成細胞壁β-1,3-葡聚糖合成相關(guān),fks1-QT的細胞壁厚度相對原始菌W303變薄了49%,β-1,3-葡聚糖的含量相對原始菌株降低60%,證明了FKS1基因?qū)Ζ?1,3-葡聚糖合成酵母細胞壁起重要的作用。fks2-QT和fks3-QT的細胞壁β-1,3-葡聚糖的含量變化不大,FKS2和FKS3基因?qū)湍讣毎谄暇厶堑暮铣捎绊懖⒉皇呛艽?并且FKS家族基因之間的疊加效果并不明顯。但是,如果在同時敲除FKS1和FKS2基因的重組菌種,細胞壁β-1,3-葡聚糖含量相對于原始菌株反而增加了,酵母細胞存在合成β-1,3-葡聚糖的其他補償途徑。(4)FKS家族基因與酵母細胞抗自溶能力的關(guān)系:在模擬自溶液中,fks1-QT和fks1,2,3-QT抗自溶能力最差,這兩株突變菌株的自溶嚴重程度和死亡率明顯高于其它菌株,FKS1在對酵母抵抗自溶的過程中起了重要的作用。fks3-QT的抗自溶能力優(yōu)于原始菌株,WSC2和MSN4基因主要作用是感受環(huán)境壓力,fks3-QT的WSC2和MSN4的基因的表達量分別上調(diào)了6.88和5.25,這兩個基因的大幅上調(diào)導致酵母細胞對于外界環(huán)境的變化敏感,在短時間內(nèi)對細胞做出調(diào)整。
【圖文】：

第一章 緒論傳特征[50]，使研究單個或多個基因的功能較為困難，因此選用單倍體模式菌株進行研究。本課題的主要研究內(nèi)容為：利用模式酵母營養(yǎng)缺陷型菌株，在前期研究中構(gòu)建的 FKS1基因敲除菌株和 FKS2 基因敲除菌株，敲除 FKS2 或 FKS3 得到雙基因敲除和三基因敲菌株；測定基因工程菌的細胞壁厚度、細胞體積、細胞壁多糖含量的變化；將基因工程菌和原始菌株置于模擬自溶環(huán)境中，對比酵母死亡率及抗自溶能力；對比關(guān)鍵基因的表達量，明確 FKS 家族基因?qū)湍讣毎螒B(tài)、酵母抗自溶能力的作用。下圖 1-1 為本研究主要的技術(shù)路線和研究內(nèi)容：

臺式高速離心機 北京醫(yī)用離心機廠微鏡 日本 OLYMPUS 公司0 分光光度計 上海天美科學儀器有限公司基及試劑養(yǎng)基：氯化鈉 10 g·L-1，酵母提取物 5 g·L-1，胰蛋白胨 10 g·L-1。在篩入的 150 μg·mL-1氨芐青霉素，固體培養(yǎng)基中添加 18-20 g·L-1的瓊脂于培養(yǎng)大腸桿菌。養(yǎng)基：葡萄糖 20 g·L-1，酵母提取物 10 g·L-1，胰蛋白胨 20 g·L-1。制20 g·L-1的瓊脂，YPD 培養(yǎng)基主要用于培養(yǎng)酵母。部分菌株培養(yǎng)時需添遺傳霉素(G418)，，YPD 培養(yǎng)基主要用于培養(yǎng)酵母。養(yǎng)基(Synthetic Dropout Medium)：無氨基酵母氮源 6.7 g·L-1，葡萄糖 2物 2 g·L-1(成分如附表 1 所示)。制備平板時添加 18-20 g·L-1的瓊脂，菌株。迫抗性平板：分別在 YPD 平板中添加 0.4 mol·L-1的 NaCl、8%的無水的米卡芬凈。
【學位授予單位】：江南大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：Q932

【參考文獻】

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本文編號：2579622