【摘要】：大熊貓(學名:Ailuropoda melanoleuca),又被人稱為“活化石”,是一種只發(fā)現(xiàn)于中國的珍貴物種,它的分布范圍包括四川西北、陜西西南、西藏東部和甘肅南部。喜食箭竹,也愛吃蜂蜜。其極低的繁殖率,導致個體數(shù)量少,我國把它列為一級保護動物。四川黑熊(學名:Ursus thibetanus mupinensis),名字還包括月熊、藏熊等,它采食的食物種類多樣,喜歡吃幼嫩葉子和真菌。亞洲南部溫暖地區(qū)是它的活動地帶,因為人類的過度捕獵行為,我國把它確定為國家二級重點保護野生動物,同時納入中國瀕危動物紅皮書。綜合來看兩個物種都有特別的研究價值。本研究根據(jù)人(Homo sapiens)、小家鼠(Mus musculus)、褐家鼠(Rattus norvegicus)、牛(Bos Taurus)、黑猩猩(Pan troglodytes)五種哺乳動物物種已知的mRNA序列為參考來設計引物;實驗材料是大熊貓和四川黑熊骨骼肌,再分別從材料中提取出總RNA和基因組DNA;然后采用反轉(zhuǎn)錄PCR、降落PCR(Touch-down PCR)技術分別進行兩個物種BANF1的表達序列和結(jié)構基因序列的擴增與克隆;把產(chǎn)物外送測序,并使用分析軟件對得到的結(jié)果進行比較、分析;分別構建了大熊貓和四川黑熊的BANF1cDNA的重組表達載體,然后將載體轉(zhuǎn)化進E.coli-BL21,進行IPTG誘導表達。本實驗給其他與大熊貓和四川黑熊的基因相關的研究提供了具體的方法和實驗經(jīng)驗。實驗結(jié)果顯示:從大熊貓和四川黑熊克隆得到的BANF1的cDNA序列有297個堿基,含有一個270 bp編碼89個氨基酸的開放閱讀框。大熊貓基因組序列長度為521 bp,四川黑熊為536 bp,都擁有2個外顯子。經(jīng)過軟件分析得出,BANF1基因的核苷酸序列、氨基酸序列的保守性比較高,這一點有一定的借鑒意義。將大熊貓分別與四川黑熊、人、小家鼠、褐家鼠、牛和黑猩猩6個物種的BANF1基因的編碼序列及其所編碼的氨基酸序列進行相似性比較,結(jié)果顯示編碼序列相似性分別為98.15%,96.6%,93.3%,93.03%,96.6%和96.6%;而氨基酸序列的相似性分別為96.63%,93.7%,92.6%,91.5%,91.1%和93.7%。把四川黑熊分別與人、小家鼠、褐家鼠、牛和黑猩猩5個物種的BANF1基因的編碼序列及其所編碼的氨基酸序列進行相似性比較,結(jié)果顯示編碼序列相似性分別為95.19%,94.10%,93.33%,92.96%和95.56%;而氨基酸序列的相似性分別為100%,96.63%,96.63%,100%和100%。拓撲預測顯示大熊貓和四川黑熊的BANF1蛋白同時含有一個蛋白激酶C磷酸化位點,一個酰胺化位點,一個酪氨酸激酶磷酸化位點,一個N-肉豆蔻酰化位點;此外,大熊貓獨有一個酪蛋白激酶II磷酸化位點。使用感受態(tài)細胞BL21進行目的蛋白的誘導表達,結(jié)果表明,BANF1蛋白含有N-末端His-標記的預期的14 kDa的多肽,累積于包涵體內(nèi)。目的蛋白經(jīng)過分離純化后,可以用于其他實驗安排。
【圖文】：

第 3 章 實驗結(jié)果、分析與討論第 3 章 實驗結(jié)果、分析與討論3.1 實驗結(jié)果3.1.1 總 RNA 和基因組 DNA 的提取結(jié)果（圖 3-1）使用濃度為 1.0%的 Agarose 進行電泳檢測總 RNA，用 0.6%的 Agarose 進因組 DNA 提取檢測，圖 3-1（a）所示，28S RNA 條帶的亮度約為 18S RNA 條亮度的兩倍，表明總 RNA 質(zhì)量較好，可以進行后續(xù)試驗；3-1（b）圖所示，組 DNA 沒有明顯降解跡象，可以進行后續(xù)實驗。

圖 3-1（a）所示，28S RNA 條帶的亮度倍，表明總 RNA 質(zhì)量較好，，可以進行后續(xù)試驗；3-有明顯降解跡象，可以進行后續(xù)實驗。圖 3-1 總 RNA(a)和 DNA（b）提取電泳圖Fig. 3-1 Results of total RNAs (a) and DNA (b) extraANF1 cDNA RT-PCR 和結(jié)構基因 PCR 結(jié)果（圖 3-2 ）
【學位授予單位】：西華師范大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：Q953

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本文編號：2577540