【摘要】：酰胺的合成不僅為植物儲存了氮素而且能消除因氨濃度過高而產(chǎn)生的毒害作用。氨毒的表現(xiàn)是使光合磷酸化解偶聯(lián),影響ATP的形成,因此對酰胺代謝相關(guān)基因的研究具有重要的理論與應(yīng)用價值。水平基因轉(zhuǎn)移(Horizontal Gene Transfer,HGT),是指在沒有生殖關(guān)系的不同物種之間遺傳物質(zhì)的交流過程。水平基因轉(zhuǎn)移是生物體除垂直遺傳外另一種獲得遺傳信息的方式。水平基因轉(zhuǎn)移事件的發(fā)生增加了生物體的遺傳變異,引起生物體功能的改進和革新,增強了生物體對環(huán)境的適應(yīng)能力。已有研究表明,陸生植物中的酰胺酶家族在進化上起源于水平基因轉(zhuǎn)移事件,并以細菌為供體。為對其進行進一步的研究,本實驗以陸生植物中酰胺酶家族成員水稻OsAMI10基因作為研究對象,利用生物信息學(xué)和反向遺傳學(xué)的方法,對該基因的起源和功能進行了初步的探討：1.以水稻OsAMI10基因作為檢索序列,對NCBI的nr蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫、Phytozome植物基因組數(shù)據(jù)庫等檢索發(fā)現(xiàn),除裸子植物挪威云杉(Piceaabies)外,其余目前已經(jīng)完成測序的陸生植物中均具與OsAMI10高度同源的基因,并且也沒有在裸子植物基因組中發(fā)現(xiàn)編碼AMI10蛋白質(zhì)的基因。對綠色植物代表性物種基因組的進化分析顯示,小立碗蘚、番茄、雷蒙德氏棉的AMI1O同源基因均是在其他物種分化之后通過基因復(fù)制的方式產(chǎn)生的。二穗短柄草的2個同源基因是通過串聯(lián)重復(fù)形成的一對同源基因。通過對內(nèi)含子相位和位置的比較發(fā)現(xiàn),盡管存在內(nèi)含子丟失和獲取等進化機制,但植物AMI1O基因的內(nèi)含子位置在大部分物種中是保守的。2.對在nr數(shù)據(jù)庫中獲得的AMI1O高度同源的基因進行了系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建,結(jié)果發(fā)現(xiàn)綠色植物的AMI10基因是單次起源的。系統(tǒng)發(fā)育樹將AMI1O高度同源的基因劃分為2個同源基因簇(A和B),植物的AMI1O基因是同源基因簇A中的細菌物種水平轉(zhuǎn)移至植物中的結(jié)果,起源的時間可能是在輪藻與chlorophyta類綠藻分化之前。3.利用一對基因組引物L(fēng)P和RP以及一個T-DNA邊界引物BP進行純合突變體鑒定,然后對鑒定為純合突變體的植株進行OsAMI10基因表達水平分析,結(jié)果表明,osami10純合突變體OsAMI10基因的表達量相比于野生型變化并不明顯,這可能是由于T-DNA插入在內(nèi)含子上從而導(dǎo)致OsAMI10基因表達變化不明顯。4.過表達和RNAi植株與野生型植株在表型上存在明顯差異。在水稻生長的全生育期分別測量野生型、過表達和RNAi植株的農(nóng)藝性狀,結(jié)果顯示,過表達植株的株高顯著高于野生型,百粒重則低于野生型；RNAi植株的分蘗、穗數(shù)和百粒重則顯著低于野生型。5.水稻OsAMI10基因可能與葉綠素合成有關(guān)。在水稻生長至四葉期測量野生型和RNAi植株的葉綠素含量,結(jié)果表明,RNAi植株的葉綠素a、葉綠素b以及葉綠素總量都極顯著地低于野生型。對OsAMI10基因進行干擾沉默會影響植株葉綠素的合成,由此推測OsAMI10基因可能與葉綠素合成有關(guān)。6.水稻OsAMI10基因的表達受氮素的調(diào)控。為明確氮素對水稻OsAMI10基因表達的影響,對Dongjin四葉期幼苗進行缺氮脅迫。結(jié)果顯示,OsAMI10基因表達受缺氮處理的抑制,在缺氮培養(yǎng)6h時達到最低值,在6h后略有上升并趨于穩(wěn)定,并在恢復(fù)供氮1d后表達量基本恢復(fù)處理之前的水平。7.水稻OsAMI10基因編碼的蛋白具有酰胺酶活性。OsAMI10蛋白結(jié)構(gòu)域預(yù)測結(jié)果顯示該蛋白屬于酰胺酶家族,可能具有酰胺酶活性。為進一步驗證這一結(jié)果,于水稻四葉期測定野生型、過表達和RNAi植株葉片谷氨酰胺酶的活性,結(jié)果顯示過表達植株和RNAi植株與野生型植株之間的差異均達到了極顯著水平,這表明水稻OsAMI10基因編碼的蛋白具有酰胺酶活性,與結(jié)構(gòu)域預(yù)測的結(jié)果相吻合。
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為進一步研究提供基礎(chǔ)。逡逑１．２憸胺酶的研究進展逡逑憸胺酶是廣泛存在于原核細胞和真核細胞中的一類水解酶（圖１．１）邋口４］，它能夠催化憸逡逑胺水解生成相應(yīng)的}舅岷桶保簦鰨欏：ò訪缸畛醣蝗銜橇虼濟福�，ＫｅP猓幔幔螅瑁椋郟擔(dān)叮菡業(yè)攪藨湴訪傅膩義匣钚暈壞�，进而证明了憸霸L贛胩於彼岬鞍酌鋼淶慕叵怠Ｈ嗣嵌宰冒訪訃易宓難繡義暇考河瀉艸な奔�，但对其窂摩机理臍ぐ并不蕟苘清楚。辶x咸镥義賢翓卞義蟍xuvｒ逡逑ｒＵｎｔｓ邐一＾逡逑ｉｋｉｅＡｉｅＷ＊＊－逡逑圖１．１憸胺酶在自然界中的分布逡逑Ｆｉｇ．邋１．１邋Ｎａｔｕｒａｌ邋ｏｃｃｕｒｒｅｎｃｅ邋ｏｆ邋ａｍｉｄａｓｅｓ邋ｉｎ邋ｎａｔｕｒｅ［５４］逡逑１．２．１焌胺酶的分類逡逑憸胺酶在自然界中存在廣泛。早期研究人員將憸胺酶主要分為兩大類：廣譜憸胺酶和逡逑立體異構(gòu)選擇性憸胺酶。目前憸胺酶常見的分類方式有很多種，這些分類主要是基于憸胺逡逑酶催化活性、進化關(guān)系、氨基酸序列等Ｐ７－Ｗ。根據(jù)催化活性將憸胺酶分為：Ｄ－氨r爛�、（Ｘ－辶x習(xí)被鶓湴訪�、脂肪酸憸霸L�、手性憸霸L�、芳祥犲繊乖L負凸閆讘湴訪福ㄍ跡保玻╁澹簦鰲８蒎義習(xí)被嶁蛄鋅桑保薹治粲趹湴訪感藕偶易宓膽湴訪負橢咀鍛湴訪浮８荽呋牧⑻逖≡皴義閑緣牟煌煞治櫻蛻湴訪負停遙蛻湴訪�。辶x

本文編號：2576621