【摘要】：禾谷縊管蚜Rhopalosiphum padi(L.)是重要的麥類作物害蟲,其廣泛分布于世界各地,能刺吸危害小麥葉片,傳播大麥黃矮病毒(Barley yellow dwarf virus,BYDV),給小麥生產(chǎn)造成重大經(jīng)濟損失。擬除蟲菊酯是一類重要的殺蟲劑,由于其殺蟲活性高,并對哺乳動物低毒,被廣泛用于防治農(nóng)業(yè)害蟲。由于長期大量的使用,許多害蟲對擬除蟲菊酯類殺蟲劑產(chǎn)生了抗藥性。面對日益增長的害蟲抗性問題,迫切需要研發(fā)作用于新靶標位點的化學殺蟲劑。本研究克隆得到禾谷縊管蚜陽離子通道RSC1基因和鈉離子通道輔助亞基基因,并進行了生物信息學及表達模式分析,研究結(jié)果能夠為開發(fā)作用于新靶標的殺蟲劑奠定基礎,且對于害蟲抗藥性治理具有重要的意義。1、禾谷縊管蚜陽離子通道基因RSC1克隆及其生物信息學分析采用RT-PCR技術(shù),克隆獲得了禾谷縊管蚜陽離子通道基因RSC1完整的開放閱讀框,其GenBank登錄號為KU640190,核苷酸長度6687 bp,編碼2228個氨基酸。在NCBI上Blastp分析發(fā)現(xiàn),該基因編碼的氨基酸序列與豌豆蚜Acyrthosiphon pisum對應基因編碼的氨基酸序列一致性最高,達到90%以上。利用TMHM-M-2.0軟件對RSC1的跨膜結(jié)構(gòu)分析結(jié)果表明,禾谷縊管蚜RSC1具有SC1通道的典型結(jié)構(gòu)特征,其整個蛋白序列包括4個同源結(jié)構(gòu)域,每個結(jié)構(gòu)域有6個跨膜區(qū)。通過與其他9種昆蟲(炓腹果蠅Drosophila melanogaster,德國小蠊Blattella germanica,赤擬谷盜Tribolium castaneum,西方蜜蜂Apis mellifera,印度跳蟻Harpegnathos saltator,熊蜂Bombus terrestris,佛羅里達弓背蟻Camponotus floridanus,豌豆蚜及切葉蟻Acromyrmex echinatior)的序列對比發(fā)現(xiàn),RSC1和其他同源通道蛋白在其四個結(jié)構(gòu)域的成孔區(qū)均有一個特殊的DEEA模體(motif)。系統(tǒng)進化分析結(jié)果顯示,RSC1基因與電壓門控鈉離子通道組成一個進化枝,電壓門控鈣離子通道為另外一個進化枝,SC1與電壓門控鈉離子通道在進化上有更近的起源關(guān)系。并且SC1類陽離子通道只存在于節(jié)肢動物中,脊椎動物尚未發(fā)現(xiàn)該類基因,該通道可能作為開發(fā)新型殺蟲劑的神經(jīng)靶標。2、禾谷縊管蚜RSC1基因在高效氯氟氰菊酯誘導下表達特性分析LC15(0.1484 mg/L)、LC35(0.3244 mg/L)兩個亞致死濃度和致死中濃度LC_(50)(0.5153mg/L)的高效氯氟氰菊酯處理禾谷縊管蚜成蚜后,qPCR結(jié)果表明,用藥劑處理6 h后,處理組RSC1基因表達量顯著低于對照組,分別為對照的0.57,0.82和0.78倍;藥劑處理24h后,RSC1基因表達量相對于對照處理為上調(diào)趨勢,表達量分別為對照的2.19,1.33和1.19倍,其中LC15處理組表達量顯著高于對照組,LC_(50)和LC35處理組的表達量與對照組表達量差異不顯著;因此,SC1通道在昆蟲中可能對維持神經(jīng)突觸的持續(xù)傳導和調(diào)節(jié)昆蟲神經(jīng)系統(tǒng)的穩(wěn)定性有著重要的作用。3、禾谷縊管蚜鈉離子通道輔助亞基克隆及其生物信息學分析RT-PCR克隆獲得禾谷縊管蚜鈉離子通道輔助亞基TipE及其同源亞基TEH1、TEH2、TEH3、TEH4基因。五個基因的開放閱讀框長度依次分別為1380、951、999、1422、1542bp,分別編碼459、299、332、473和513個氨基酸。禾谷縊管蚜與炓腹果蠅的輔助亞基的氨基酸序列相似性較低,而與豌豆蚜的輔助亞基的氨基酸序列一致性最高,達到80%以上。采用Kyte and Doolittle軟件分析禾谷縊管蚜RpTipE氨基酸殘基的疏水性結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)其包含有兩個跨膜區(qū),該拓撲結(jié)構(gòu)與哺乳動物β亞基(Slo-β)相似。構(gòu)建禾谷縊管蚜與豌豆蚜鈉離子通道輔助亞基系統(tǒng)發(fā)育樹顯示,兩種昆蟲的TipE亞基與其同源亞基TEH1-4分別各占一枝,同源亞基TEH1和TEH2,TEH3和TEH4之間親緣關(guān)系比較相近。此外,建立昆蟲鈉離子通道輔助亞基與脊椎動物鈉離子通道輔助亞基系統(tǒng)進化樹顯示,該發(fā)育樹分為兩大支,包括脊椎動物鈉離子通道輔助亞基β亞基和昆蟲鈉離子通道輔助亞基在系統(tǒng)進化樹分為兩大支。因此,昆蟲鈉離子通道輔助亞基可能成為一個潛在的新化學靶標。4、禾谷縊管蚜鈉離子通道輔助亞基表達模式分析實時熒光定量PCR結(jié)果表明,鈉離子通道輔助亞基TipE及其同源亞基TEH1-4在禾谷縊管蚜整個發(fā)育歷期均有表達,但5個基因在其不同發(fā)育時期表達的變化規(guī)律不同。此外,本研究檢測并分析了禾谷縊管蚜在高效氯氟氰菊酯亞致死濃度LC_(25)(0.2544 mg/L)和致死中濃度LC_(50)(0.5153 mg/L)處理后12 h和24 h,TipE-like共5個基因的相對表達量變化。研究結(jié)果表明,12 h后LC_(25)處理組,TipE,TEH1,TEH2,TEH3和TEH4基因表達量為下調(diào)趨勢,表達量分別為對照的0.59、0.28、0.28、0.27和0.26倍;處理組表達量顯著低于清水對照組。LC_(50)處理后12 h,表達量分別為對照的0.41、0.32、0.22、0.41和0.30倍;處理組表達量顯著低于清水對照組。處理后24 h,5個基因表達量為下調(diào)趨勢。LC_(25)亞致死濃度處理后24h,表達量分別為對照的0.55、0.44、0.34、0.13和0.42倍;處理組表達量顯著低于清水對照組。LC_(50)處理后24h后,表達量分別為對照的0.49、0.33、0.31、0.12和0.38倍;處理組表達量顯著低于清水對照組;施藥后24h,LC_(25)和LC_(50)兩組施藥處理組表達量差異不顯著。因此,昆蟲鈉離子通道輔助亞基在調(diào)節(jié)其鈉離子通道的門控性質(zhì)可能起到重要的作用。
【圖文】：

圖 1-1 哺乳動物電壓門控鈉離子通道結(jié)構(gòu)（Catterall et al. 2005）Fig. 1-1 The structure of voltage-gated sodium channel of mammal（Catterall et al. 2005）1.3.2 昆蟲鈉離子通道的結(jié)構(gòu)和功能昆蟲只有一個編碼鈉離子通道α亞基的基因（Loughney et al. 1989；Dong 2010）。盡管只有一個單基因，但昆蟲轉(zhuǎn)錄時存在廣泛的選擇性剪切和 RNA 編輯，從而產(chǎn)生許多功能和藥理獨特的鈉離子通道變體（Dong 2007 2010）。然而，通過分析黑腹果蠅基因組，，發(fā)現(xiàn)其缺乏哺乳動物鈉離子通道β亞基的直系同源蛋白質(zhì)（Littleton & Ganetzky2000）。學者發(fā)現(xiàn)，黑腹果蠅的 para 基因可以編碼大量具有重要生理功能的鈉離子通道α亞基（Loughneyet al. 1989）。然而，將 para 基因的 cRNA 注射到非洲爪蟾卵母細胞時，不能使電壓敏感性鈉離子電流強烈表達，除非注射高濃度的 cRNA 并通過長時間孵育（Feng et al. 1995）。 隨后學者發(fā)現(xiàn)，由黑腹果蠅 TipE 基因編碼的小蛋白質(zhì)能增強 para 鈉離子通道在非洲爪蟾卵母細胞中的表達，并且還可以使 para 鈉離子通道發(fā)生動力學失活（Feng et al. 1995；Warmke et al. 1997）。這些結(jié)果表明 TipE 蛋白可能是鈉離子通道的輔助亞基，其功能與作用方式類似脊椎動物鈉離子通道β亞基。

圖 1-2 與擬除蟲菊酯抗藥性相關(guān)的昆蟲電壓門控鈉離子通道突變位點（Dong et al., 2014Fig. 1-2 The pyrethroid resistance-associated mutation of voltage-gated sodium channel genes repoinsects (Dong et al., 2014)在 IIS6 上 L1014F 突變是第一個被發(fā)現(xiàn)與 kdr 抗藥性相關(guān)的突變位點（Smith1997b；Vais et al. 2000）。自第一次在家蠅和蟑螂中報道該位點發(fā)生突變（Williamal. 1996；Dong 1997），學者還在其他昆蟲發(fā)現(xiàn)該位點突變成 F，H，S，C 或 W 氨分析菊酯類抗藥性種群發(fā)現(xiàn)，單個位點替換的多樣性并不只有 L101（L1014F/H/S/C在電壓門控鈉離子通道其他位點也發(fā)現(xiàn)類似的替換，如 IS6 上的 V410（M/A/G/L）和上的 M918（T/L/V）。這些突變及替換位點的多樣性可能與過去使用不同類型的菊殺蟲劑有關(guān)。例如，鈉離子通道上的 M918T 突變對芐氯菊酯和溴氰菊酯極不敏感et al. 2000），但其對 DDT 敏感（Usherwood et al. 2005），鈉離子通道上 F1534C使其對 I 類型菊酯類殺蟲劑不敏感，但對 II 類型菊酯類殺蟲劑敏感（Hu et al. 201同樣，L1014F，L1014H 和 L1014S 突變對 I 和 II 類型的菊酯類殺蟲劑或 DDT 敏感不同（Burton et al. 2011）。
【學位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：S435.12

【參考文獻】

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本文編號：2576002