【摘要】：稻米是亞洲國家和一些西方國家的主食。在谷物類蛋白中,大米蛋白質(zhì)量最優(yōu)。然而,在一部分人群中,大米蛋白也可誘發(fā)過敏反應。14-16 kDaα-淀粉酶/胰蛋白酶抑制劑是大米中的主要過敏原。本研究采用基因工程技術(shù)獲得對應14-16 kDaα-淀粉酶/胰蛋白酶抑制劑的重組蛋白RAG2,并利用重組蛋白制備抗14-16 kDaα-淀粉酶/胰蛋白酶抑制劑的兔多克隆抗體,建立間接競爭Elisa法,用于篩選不同的大米品種,期待獲得具有低致敏性的大米品種。研究的主要方法及結(jié)論如下:1.利用基因合成技術(shù)合成14-16 kDaα-淀粉酶/胰蛋白酶抑制劑的基因RAG2,選用pSUMO-Mutant質(zhì)粒載體和大腸桿菌E.coliBL21(DE3)pLysS作為表達系統(tǒng),將基因連接到pSUMO-Mutant載體上,構(gòu)建pSUMO-RAG2重組質(zhì)粒,轉(zhuǎn)化至大腸桿菌ER2925中進行大量克隆擴增,提取質(zhì)粒進行限制性內(nèi)切酶酶切分析,顯示合成的RAG2基因序列正確。2.pSUMO-RAG2重組質(zhì)粒在E.coli BL21(DE3)pLysS中成功誘導表達,追蹤SUMO-RAG2融合蛋白,發(fā)現(xiàn)它是細胞內(nèi)的不溶性的包涵體表達;對包涵體進行變性與復性,并通過Ni柱進行親和層析獲得SUMO-RAG2融合蛋白。3.免疫家兔,制備出抗大米過敏原14-16 kDaα-淀粉酶/胰蛋白酶抑制劑的多克隆抗體,其效價高達1:320,000。4.收集江西28個水稻品種,提取鹽溶性蛋白,采用SDS-PAGE電泳和基于抗RAG2多克隆抗體的免疫印跡法檢測28個品種的過敏原RAG2含量,結(jié)果初步顯示,這28個品種中不與抗RAG2的抗血清反應,最后選用間接競爭Elisa方法測出每個品種的IC50,從而篩選出抗原性低的大米品種。
【圖文】：

第 1 章 前言白的氨基酸序列，尤其是其中半胱氨酸殘基的數(shù)目和位置，與小麥的 α-淀粉酶/胰蛋白酶抑制劑非常相似。α-淀粉酶/胰蛋白酶抑制劑面包師哮喘的主要過敏原，屬于植物性食物過敏原中的醇溶谷蛋白4～16 kD 過敏蛋白包括 RAG1、RAG2 和 RA5 基因片段，其中 RAation activating gene 1）被認為是大米中主要過敏原，，它編碼大米 16 艷芳等[11]通過 DNAStar Protean 生物信息學軟件采用多方案和多參1 的氨基酸序列，預測其二級結(jié)構(gòu)和 B 細胞表位，得出了第 33～44155～163 區(qū)段可能是 B 細胞的優(yōu)勢表位。

圖 2.1 pSUMO-RAG2 圖譜Fig2.1 the map of pSUMO-RAG22 pSUMO-RAG2 的酶切鑒定從 ER2925 中提取重組質(zhì)粒 pSUMO-RAG2，對重組質(zhì)粒進行單酶切，采用瓊脂糖凝膠電泳檢測，從圖 2.2 可以看到在 7,000bp 下方有明亮的基數(shù)與重組質(zhì)粒 pSUMO-RAG2 的堿基數(shù) 6038bp 相符；雙酶切泳道 400 下方有明亮的條帶，其堿基數(shù)與基因 RAG2 的堿基數(shù) 436bp 相符。定電泳圖如下：
【學位授予單位】：南昌大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：TS210.7

【參考文獻】

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本文編號：2573765