【摘要】：七鰓鰻屬于無(wú)頜類脊椎動(dòng)物,處于向有頜類進(jìn)化的節(jié)點(diǎn)。它們不僅有先天免疫系統(tǒng),還有一套不同于有頜類脊椎動(dòng)物的適應(yīng)性免疫系統(tǒng)。因此,其進(jìn)化地位和免疫系統(tǒng)顯得尤為獨(dú)特。本文首次從七鰓鰻體內(nèi)克隆到了其分化簇基因CD63,并利用生物信息學(xué)和實(shí)時(shí)定量PCR以及功能片段的重組表達(dá)、Western blot、真核轉(zhuǎn)染等方法對(duì)其進(jìn)行了初步的分析,為探討CD63在七鰓鰻的免疫應(yīng)答中的作用提供了一定的理論依據(jù)。CD63參與眾多的生物學(xué)過(guò)程,比如免疫過(guò)程、細(xì)胞遷移過(guò)程和癌癥的發(fā)展等。目前的研究多集中于哺乳動(dòng)物和細(xì)胞方面。本文首次從古老的無(wú)頜類動(dòng)物——七鰓鰻中克隆獲得了CD63基因(LjCD63),并成功表達(dá)了其功能片段(Extracellular loop 2,EC2)。LjCD63的ORF區(qū)有738bp,編碼245個(gè)氨基酸,其理論分子量約為26.48kDa,理論等電點(diǎn)為6.79,該區(qū)并無(wú)信號(hào)肽,但是具有四次跨膜結(jié)構(gòu)域,為疏水性蛋白質(zhì)。該蛋白可能存在N型糖基化和棕櫚�；F(xiàn)象。在功能區(qū)域EC2中,有Q(X)4GCC(X)5DW模式(X為任意氨基酸)、VPDSCC短肽;在C末端則有G(S/E)YE(Q)V(T)M(V)。這些較為保守的模塊可能對(duì)LjCD63的功能有重要作用。qPCR結(jié)果顯示,LPS刺激后,LjCD63在肝臟中出現(xiàn)顯著上調(diào),暗示CD63可能與肝臟內(nèi)的免疫過(guò)程有關(guān)。Lj CD63 ORF區(qū)的重組蛋白(recombinant LjCD63,rLjCD63)在傳統(tǒng)的原核表達(dá)系統(tǒng)中難于表達(dá),其功能片段EC2區(qū)的重組蛋白(rLjCD63 EC2)則易于表達(dá),其最優(yōu)的表達(dá)條件為:IPTG濃度為0.5mM,誘導(dǎo)溫度為20℃。Western blot結(jié)果說(shuō)明,抗人CD63 EC2區(qū)的多克隆抗體(anti-human CD63 EC2 polyclonal antibody,anti-hCD63)可以與日本七鰓鰻CD63 EC2區(qū)的重組蛋白相互結(jié)合。但是,免疫組織化學(xué)的初步結(jié)果顯示,制備特異性較高的七鰓鰻CD63 EC2區(qū)的抗體是必要的。利用以綠色熒光蛋白GFP為標(biāo)記的LjCD63真核轉(zhuǎn)染結(jié)果表明,LjCD63主要定位在細(xì)胞膜上及細(xì)胞內(nèi)部的某些特定的結(jié)構(gòu)中,提示LjCD63可能在膜結(jié)構(gòu)上與來(lái)自細(xì)胞外部或細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的分子發(fā)生相互作用進(jìn)而影響細(xì)胞的功能。在七鰓鰻體內(nèi),LjCD63的具體作用機(jī)制還有待進(jìn)一步闡明。
【圖文】：

遼寧師范大學(xué)碩士學(xué)位論文高的 GC 含量，即所謂的“GpC 島”。5’端的-123~-130 處有轉(zhuǎn)錄因子位點(diǎn)[22]，這個(gè)位點(diǎn)可能在啟動(dòng)其轉(zhuǎn)錄方面比較關(guān)鍵。 相對(duì)分子量為 25,475D，是 Tetraspanins 超家族成員之一。經(jīng)軟件分和空間三維結(jié)構(gòu)如圖 1.1 所示。其中，，A 圖中的數(shù)字表示氨基酸個(gè)可以看出，CD63 是一種具有 4 個(gè)α螺旋的四次跨膜蛋白。

遼寧師范大學(xué)碩士學(xué)位論文.1 A 是從日本七鰓鰻的心臟中提取的 RNA，然后用 2%的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，所提RNA的 28S、18S 非常清晰。利用紫外分光光度計(jì)測(cè)得的 OD20 左右。說(shuō)明 RNA 樣品未出現(xiàn)降解且純度也達(dá)到了下一步實(shí)驗(yàn)的要求。jCD63 序列擴(kuò)增及鑒定轉(zhuǎn)錄后的心臟cDNA為模板, LjCD63 Forward及LjCD63 Reverse引物進(jìn)行，得到 LjCD63 ORF 區(qū) DNA 片段 (圖 2.1 B)。將圖 2.2 中的目的片段切膠回MD18 T 載體后，轉(zhuǎn)化至 E. coli JM109 菌體中，挑選單菌落過(guò)夜培養(yǎng)，以模板，用 LjCD63 上下游引物做質(zhì)粒 PCR 鑒定 (圖 2.1 C)，并將質(zhì)粒送上NA 測(cè)序，對(duì)測(cè)序結(jié)果分析，得到準(zhǔn)確的 LjCD63 ORF 區(qū), 序列如圖 2.2 所信息提交到 NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù) (KT225459)。
【學(xué)位授予單位】：遼寧師范大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：Q78

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本文編號(hào)：2569847