【摘要】：目的:構(gòu)建含有神經(jīng)生長因子(β-NGF)慢病毒表達(dá)載體p LVX-TRE3G-IRES-β-NGF,使用Tet-on 3G四環(huán)素誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng),研究不同劑量強力霉素(Dox)誘導(dǎo)β-NGF基因表達(dá)對體外培養(yǎng)角膜緣干細(xì)胞(LSCs)增殖的影響。方法:1、從SD大鼠腦組織提取總RNA,逆轉(zhuǎn)錄成c DNA,利用分子生物學(xué)技術(shù),克隆鼠的β-NGF基因完整編碼區(qū),將β-NGF基因定向插入載體p LVX-TRE3G-IRES中。2、將重組載體p LVX-TRE3G-IRES-β-NGF和載體p LVX-Tet3G分別轉(zhuǎn)染HEK293FT細(xì)胞,制備收獲慢病毒;共感染空白HEK293FT細(xì)胞,同時用不同劑量強力霉素(Dox)誘導(dǎo)NGF表達(dá)(分為未轉(zhuǎn)染組、0、100、500和1000ng/ml Dox誘導(dǎo)表達(dá)組)。48h后,收集細(xì)胞,western-blot檢測各組細(xì)胞內(nèi)β-NGF表達(dá)情況。同時收集培養(yǎng)上清,(1)Elisa檢測各組上清內(nèi)β-NGF的分泌量;(2)制作條件培養(yǎng)基,加入PC-12細(xì)胞培養(yǎng)基中進行誘導(dǎo)培養(yǎng),觀察PC-12細(xì)胞誘導(dǎo)分化情況。3、體外培養(yǎng)LSCs,慢病毒共感染LSCs,分為對照組(未轉(zhuǎn)染組)和誘導(dǎo)表達(dá)組[實驗組A(p LVX-TRE3G-IRES-β-NGF和p LVX-Tet3G共感染,Dox 1000ng/ml)、實驗組B(p LVX-TRE3G-IRES-β-NGF和p LVX-Tet3G共感染,Dox 100ng/ml)、實驗組C(p LVX-TRE3G-IRES和p LVX-Tet3G共感染,Dox1000ng/ml)]進行培養(yǎng),分別選取各組誘導(dǎo)表達(dá)48h后的細(xì)胞,細(xì)胞免疫熒光染色檢測NGF、p63、Trk A、p38表達(dá)。4、相關(guān)數(shù)據(jù)作統(tǒng)計學(xué)分析。結(jié)果:1.雙酶切和測序鑒定重組質(zhì)粒p LVX-TRE3G-IRES-β-NGF序列和方向正確。2、β-NGF在轉(zhuǎn)染細(xì)胞內(nèi)被誘導(dǎo)表達(dá),隨著Dox劑量增加,表達(dá)量增強;β-NGF在細(xì)胞培養(yǎng)基的上清內(nèi)表達(dá),表達(dá)量隨Dox劑量增加而增多。3、誘導(dǎo)表達(dá)的條件培養(yǎng)基可誘導(dǎo)PC-12細(xì)胞形態(tài)改變,表達(dá)神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)蛋白。4、NGF在LSCs內(nèi)被誘導(dǎo)表達(dá),隨著Dox劑量增加,NGF表達(dá)量增強;各實驗組p63、Trk A隨著NGF的表達(dá)量增加而降低,p38表達(dá)量的隨著NGF的表達(dá)量增加而增加。結(jié)論:1、成功重組慢病毒載體p LVX-TRE3G-IRES-β-NGF,轉(zhuǎn)染后β-NGF基因能夠在HEK293FT細(xì)胞中表達(dá)和分泌,且該蛋白具有誘導(dǎo)PC-12細(xì)胞向神經(jīng)元樣細(xì)胞分化的能力。2、運用Tet-On 3G四環(huán)素誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng),可成功在LSCs獲得不同劑量NGF蛋白表達(dá),低劑量誘導(dǎo)組誘導(dǎo)表達(dá)NGF能夠保持LSCs干細(xì)胞特性且對其具有促進增殖的作用。
【圖文】：

.1.5 主要實驗試劑的配制.1.5.1細(xì)胞培養(yǎng)液配制：PC-12細(xì)胞未分化培養(yǎng)基：15%馬血清，5%胎牛血清（FBS），1%1640培養(yǎng)基至100ml，4℃保存?zhèn)溆�；PC-12細(xì)胞分化培養(yǎng)基：15%馬血清，1%PS，加1640培養(yǎng)基至100m備用；HEK293FT細(xì)胞：10%胎牛血清（FBS），1%PS，加H-DMEM至10存?zhèn)溆茫籐SCs：20%胎牛血清（FBS），1%PS，加F12培養(yǎng)基至100ml，4℃保凍存液：90%胎牛血清（FBS），10%DMSO混合均勻，現(xiàn)配現(xiàn)用.1.5.2 藥物配制：誘導(dǎo)劑強力霉素（Dox）：稱取10mg Dox加入100ml 3dH2O，0.22圖1．四環(huán)素誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)載體圖譜Fig.1 Tet-Express System vector map

劇烈振蕩15s，，靜置5min，新的Epp管中，重復(fù)上一步的操作；的Epp管中加入已預(yù)冷的異丙醇0.中取出，12000g/min，離心10min（%乙醇（0.25ml的DEPC水+0.75ml的in，離心5分鐘（4℃），棄上清；加入10μl DEPC水溶解RNA，55℃放其純度及濃度；1μl的6×上樣緩沖液混勻，配1.5%電泳20分鐘。取電泳產(chǎn)物見三條帶
【學(xué)位授予單位】：貴州醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R772.2

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本文編號：2566105