毛竹PheDof4-1基因克隆及表達(dá)分析
發(fā)布時間：2019-11-24 04:35
【摘要】：Dof(DNA binding with one finger)蛋白是植物特有的一類轉(zhuǎn)錄因子,由多基因共同編碼,參與植物轉(zhuǎn)錄調(diào)控、生長發(fā)育及脅迫響應(yīng)等生物學(xué)過程。以毛竹為研究對象,克隆了1個Dof基因,命名為Phe Dof4-1,基因長度為1 473 bp,推測其蛋白質(zhì)產(chǎn)物的分子量是53.2 kDa,等電點為8.05。qRT PCR結(jié)果顯示,Phe Dof4-1在低溫和250 mmol·L~(-1) Na Cl處理的幼莖中誘導(dǎo)表達(dá),而在20%PEG8000處理的根中表達(dá)則受到強(qiáng)烈抑制,在葉片中不同處理條件下呈現(xiàn)不同的表達(dá)趨勢。研究結(jié)果為Phe Dof4-1在非生物脅迫中的作用提供理論依據(jù),為竹子分子育種提供參考。
【圖文】：
T-PCR），檢測目的基因表達(dá)情況。TIP41基因作為內(nèi)參基因[32]，引物見表1，每個反應(yīng)設(shè)置3個生物學(xué)重復(fù)，生物技術(shù)和數(shù)據(jù)均使用RocheLightCycler480儀器進(jìn)行分析，利用2-ΔΔCT法[33]分析3次生物學(xué)試驗的數(shù)據(jù)，Excel進(jìn)行作圖。2結(jié)果與分析2.1PheDof4-1基因克隆以PheDof4-1-F和PheDof4-1-R為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，PCR反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)0.8%的瓊脂糖凝膠電泳，在1000～2000bp之間有一條清晰的亮帶（見圖1），連接pGEM-Teasy載體，進(jìn)行測序（上海生工生物工程公司），序列長度為1473bp。M：Marker；1：PCR產(chǎn)物圖1PheDof4-1基因PCR產(chǎn)物電泳圖Figure1ElectrophoresisofPCRproductforPheDof4-1geneM:DL2000marker;lane1.PCRproducts2.2生物信息學(xué)分析PheDof4-1基因編碼490個氨基酸，蛋白質(zhì)的分子量為53.20kDa，等電點為8.06。氨基酸序列結(jié)構(gòu)分析表明，PheDof4-1蛋白含有典型的完整的zf-dof結(jié)構(gòu)，結(jié)構(gòu)域位于105K到166S之間。PheDof4-1基因起始密碼子上游約2.5kb序列進(jìn)行順勢作用元件分析，發(fā)現(xiàn)含有TATA-box，CAAT-box等典型的真核生物順勢調(diào)控元件，還含有其他重要的作用元件，主要參與光響應(yīng)、非生物脅迫和激素應(yīng)答等相關(guān)調(diào)控。其中，光應(yīng)答元件數(shù)量最多為11個，如G-Box、GAG-motif、AE-box、ATCT-motif和BoxII等調(diào)控元件，該基因還含有非生物脅迫響應(yīng)的元件，如逆境響應(yīng)元件TC-richrepeats，干旱誘導(dǎo)元件MBS，此外，還存在一些與赤霉素和水楊酸等激素相關(guān)元件如：GARE-motif、TATC-box和TCA-element等多種調(diào)控元件。對PheDof4-1基因組序列進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析，結(jié)果顯示其含有2個外顯子和1個內(nèi)含子，如圖2所示。圖2PheDof4-1基因結(jié)構(gòu)分析Figure2GenestructureanalysisofPheDof4-1將PheDof4-1與水稻、小麥、玉米、高粱、大
44卷3期劉俊等:毛竹PheDof4-1基因克隆及表達(dá)分析401分支上的數(shù)字為1000次重復(fù)搜索的靴帶值Numbersonbranchesindicatebootstrapestimatesfor1000replicates圖3不同物種Dof蛋白進(jìn)化樹值Figure3PhylogenetictreeofDofproteinsindifferentspecies1～16分別代表不同樣本的RNA1-16respectivelyrepresentdifferentsamplesofRNA圖4毛竹RNA瓊脂糖凝膠電泳Figure4TheelectrophoresisofRNAofmosobamboo圖5PheDof4-1在干旱脅迫條件下的相對表達(dá)量Figure5TherelativeexpressionofPheDof4-1under20%PEG8000treatment2.5鹽處理下PheDof4-1基因表達(dá)模式在鹽脅迫處理下，PheDof4-1在不同組織中的表達(dá)模式如圖6所示：在根中，PheDof4-1的表達(dá)呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢，在處理1h時表達(dá)量最低，僅為對照的0.17倍，隨后逐漸升高，在處理24h時，表達(dá)量恢復(fù)正常，最后趨于穩(wěn)定水平；在幼莖中，PheDof4-1的轉(zhuǎn)錄水平隨著處理時間的延長，呈現(xiàn)增加的趨勢，在處理12h時，表達(dá)量達(dá)到峰值，為對照組的2.2倍，隨后表達(dá)逐漸降低；在葉片中，PheDof4-1基因的表達(dá)先升高后降低，處理1h時，表達(dá)量迅速升高，為對照組的2.4倍，隨后逐漸下降，在處理12h，表達(dá)量降到最低值，僅為對照的3/10，，隨后，表達(dá)量逐漸上升，恢復(fù)正常。PheDof4-1在不同組織中呈現(xiàn)不同的表達(dá)趨勢，說明該基因在不同組織中呈現(xiàn)不同的表達(dá)水平。圖6PheDof4-1在鹽脅迫條件下的相對表達(dá)量Figure6TherelativeexpressionofPheDof4-1under250mmol·L-1Nacltreatment2.6冷處理下PheDof4-1基因表達(dá)模式在冷脅迫處理下，PheDof4-1基因受到誘導(dǎo)表達(dá)，結(jié)果如圖7所示。在根中，PheDof4-1的表達(dá)
本文編號：2565276
【圖文】：
T-PCR），檢測目的基因表達(dá)情況。TIP41基因作為內(nèi)參基因[32]，引物見表1，每個反應(yīng)設(shè)置3個生物學(xué)重復(fù)，生物技術(shù)和數(shù)據(jù)均使用RocheLightCycler480儀器進(jìn)行分析，利用2-ΔΔCT法[33]分析3次生物學(xué)試驗的數(shù)據(jù)，Excel進(jìn)行作圖。2結(jié)果與分析2.1PheDof4-1基因克隆以PheDof4-1-F和PheDof4-1-R為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，PCR反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)0.8%的瓊脂糖凝膠電泳，在1000～2000bp之間有一條清晰的亮帶（見圖1），連接pGEM-Teasy載體，進(jìn)行測序（上海生工生物工程公司），序列長度為1473bp。M：Marker；1：PCR產(chǎn)物圖1PheDof4-1基因PCR產(chǎn)物電泳圖Figure1ElectrophoresisofPCRproductforPheDof4-1geneM:DL2000marker;lane1.PCRproducts2.2生物信息學(xué)分析PheDof4-1基因編碼490個氨基酸，蛋白質(zhì)的分子量為53.20kDa，等電點為8.06。氨基酸序列結(jié)構(gòu)分析表明，PheDof4-1蛋白含有典型的完整的zf-dof結(jié)構(gòu)，結(jié)構(gòu)域位于105K到166S之間。PheDof4-1基因起始密碼子上游約2.5kb序列進(jìn)行順勢作用元件分析，發(fā)現(xiàn)含有TATA-box，CAAT-box等典型的真核生物順勢調(diào)控元件，還含有其他重要的作用元件，主要參與光響應(yīng)、非生物脅迫和激素應(yīng)答等相關(guān)調(diào)控。其中，光應(yīng)答元件數(shù)量最多為11個，如G-Box、GAG-motif、AE-box、ATCT-motif和BoxII等調(diào)控元件，該基因還含有非生物脅迫響應(yīng)的元件，如逆境響應(yīng)元件TC-richrepeats，干旱誘導(dǎo)元件MBS，此外，還存在一些與赤霉素和水楊酸等激素相關(guān)元件如：GARE-motif、TATC-box和TCA-element等多種調(diào)控元件。對PheDof4-1基因組序列進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析，結(jié)果顯示其含有2個外顯子和1個內(nèi)含子，如圖2所示。圖2PheDof4-1基因結(jié)構(gòu)分析Figure2GenestructureanalysisofPheDof4-1將PheDof4-1與水稻、小麥、玉米、高粱、大
44卷3期劉俊等:毛竹PheDof4-1基因克隆及表達(dá)分析401分支上的數(shù)字為1000次重復(fù)搜索的靴帶值Numbersonbranchesindicatebootstrapestimatesfor1000replicates圖3不同物種Dof蛋白進(jìn)化樹值Figure3PhylogenetictreeofDofproteinsindifferentspecies1～16分別代表不同樣本的RNA1-16respectivelyrepresentdifferentsamplesofRNA圖4毛竹RNA瓊脂糖凝膠電泳Figure4TheelectrophoresisofRNAofmosobamboo圖5PheDof4-1在干旱脅迫條件下的相對表達(dá)量Figure5TherelativeexpressionofPheDof4-1under20%PEG8000treatment2.5鹽處理下PheDof4-1基因表達(dá)模式在鹽脅迫處理下，PheDof4-1在不同組織中的表達(dá)模式如圖6所示：在根中，PheDof4-1的表達(dá)呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢，在處理1h時表達(dá)量最低，僅為對照的0.17倍，隨后逐漸升高，在處理24h時，表達(dá)量恢復(fù)正常，最后趨于穩(wěn)定水平；在幼莖中，PheDof4-1的轉(zhuǎn)錄水平隨著處理時間的延長，呈現(xiàn)增加的趨勢，在處理12h時，表達(dá)量達(dá)到峰值，為對照組的2.2倍，隨后表達(dá)逐漸降低；在葉片中，PheDof4-1基因的表達(dá)先升高后降低，處理1h時，表達(dá)量迅速升高，為對照組的2.4倍，隨后逐漸下降，在處理12h，表達(dá)量降到最低值，僅為對照的3/10，，隨后，表達(dá)量逐漸上升，恢復(fù)正常。PheDof4-1在不同組織中呈現(xiàn)不同的表達(dá)趨勢，說明該基因在不同組織中呈現(xiàn)不同的表達(dá)水平。圖6PheDof4-1在鹽脅迫條件下的相對表達(dá)量Figure6TherelativeexpressionofPheDof4-1under250mmol·L-1Nacltreatment2.6冷處理下PheDof4-1基因表達(dá)模式在冷脅迫處理下，PheDof4-1基因受到誘導(dǎo)表達(dá)，結(jié)果如圖7所示。在根中，PheDof4-1的表達(dá)
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