發(fā)布時(shí)間：2019-11-17 15:25

【摘要】：為探究花青素調(diào)控基因AtPAP1的生物學(xué)功能,采用PCR方法從擬南芥花序中克隆出擬南芥MYB家族AtPAP1基因。構(gòu)建植物表達(dá)載體pROKⅡ-AtPAP1,并通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉盤(pán)法將外源基因轉(zhuǎn)入野生型煙草。檢測(cè)結(jié)果表明,AtPAP1已成功整合入煙草基因組中,并在mRNA水平表達(dá)。形態(tài)觀察顯示AtPAP1基因異源過(guò)量表達(dá)能顯著增強(qiáng)轉(zhuǎn)基因煙草植株花青素的積累,致使轉(zhuǎn)基因煙草的葉片、莖段和花器官等顏色發(fā)生變化,呈現(xiàn)出不同程度的紫紅色。
【圖文】：

?光光度計(jì)在480、649和665nm波長(zhǎng)下測(cè)量光密度值。根據(jù)公式計(jì)算葉綠素含量。Chla含量(mg·g-1)=0.005×(12.19×OD665 3.45×OD649)/質(zhì)量;Chlb含量(mg·g-1)=0.005×(21.99×OD649 5.32×OD665)/質(zhì)量;Car含量(mg·g-1)=0.005×[1000×OD480 2.14×(12.19×OD665 3.45×OD649) 70.16×(21.99×OD649 5.32×OD665)]×220-1/質(zhì)量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果1擬南芥AtPAP1基因的克隆及植物表達(dá)載體的構(gòu)建利用TaKaRaMiniBESTPlantRNAExtractionKit試劑盒提取擬南芥花序的總RNA(圖1-A)。以反轉(zhuǎn)錄后的cDNA為模板擴(kuò)增AtPAP1基因。AtPAP1基因(GenBank登錄號(hào)AY519563.1)的ORF長(zhǎng)度為747bp,共編碼248個(gè)氨基酸,該基因編碼蛋白的分子量為28.5kDa,蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)為9.20。利用限制性?xún)?nèi)切酶XbaI和SacI對(duì)AtPAP1目的片段和pROKII載體進(jìn)行雙酶切反應(yīng),用DNAligaseKit進(jìn)行連接反應(yīng),重組載體暫命名為pROKII-圖1植物表達(dá)載體pROKII-AtPAP1的構(gòu)建Fig.1TheconstructionofpROKII-AtPAP1vectorA:擬南芥花序總RNA的瓊脂糖凝膠電泳圖,1、2:擬南芥花序總RNA;B:植物表達(dá)載體pROKII-AtPAP1構(gòu)建的凝膠電泳圖,M:DNAmarkerDL5000,1、2:AtPAP1基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物,3:pROKII-AtPAP1質(zhì)粒用XbaI和SacI進(jìn)行雙酶切檢測(cè)電泳圖,4~8:5個(gè)pROKII-AtPAP1重組載體的PCR產(chǎn)物。

1202植物生理學(xué)報(bào)AtPAP1。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入大腸桿菌Trans1-T1感受態(tài)細(xì)胞中,隨機(jī)挑取單克隆經(jīng)pROKII載體通用引物PCR驗(yàn)證并提取質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切檢測(cè),最終將陽(yáng)性質(zhì)粒送公司測(cè)序檢測(cè)。測(cè)序結(jié)果表明,AtPAP1基因已經(jīng)重組到pROKII載體上,沒(méi)有堿基序列突變,pROKII-AtPAP1載體構(gòu)建成功(圖1-B)。2pROKII-AtPAP1載體在煙草中的遺傳轉(zhuǎn)化與檢測(cè)采用葉盤(pán)轉(zhuǎn)化法,將農(nóng)桿菌GV3101(pROKII-AtPAP1)侵染煙草葉片,經(jīng)過(guò)4~5周的選擇培養(yǎng),從葉片周?chē)挠鷤M織分化出紅色或淡紅色的抗性芽(圖2-A)。將抗性芽分離后,放在含有卡那抗生素的分化培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng),得到大量從生芽(圖2-B),待叢生芽抽莖后,移栽至生根培養(yǎng)基中進(jìn)行生根培養(yǎng)(圖2-C)。提取11個(gè)生長(zhǎng)30d的轉(zhuǎn)基因煙草抗性苗葉片總RNA,利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)AtPAP1基因在不同轉(zhuǎn)基因株系中的相對(duì)表達(dá)量,結(jié)果如圖2-D。在11個(gè)株系中均有AtPAP1基因表達(dá),基因相對(duì)表達(dá)量從高到低排序依次為:L4>L1>L9>L6>L5>L8>L11>L3>L10>L7>L2。選取相對(duì)表達(dá)量不同的的5個(gè)株系(L4、L9、L5、L11、L2)移栽至土質(zhì)培養(yǎng)基中。2周后,觀察到轉(zhuǎn)基因株系呈現(xiàn)出由綠色至紫紅色的顏色變化,且與AtPAP1基因的表達(dá)量成正相關(guān)(圖2-E)。3轉(zhuǎn)基因植株形態(tài)學(xué)觀察選取表達(dá)量低(L2)、中(L5、L8和L11)和高(L1、L4和L9)的轉(zhuǎn)基因植株和野生型植株移栽到土壤,2周左右,用顯微鏡分別觀察葉片形態(tài)變化。與野生型相比,轉(zhuǎn)基因植株隨著表達(dá)量的不同均呈現(xiàn)出不同顏色差異變化,主要表現(xiàn)為葉片下表皮整體變紅、主葉脈變紅、下表皮上出現(xiàn)點(diǎn)狀或側(cè)葉脈變紅等,而在野生型中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)這些變化。即AtPAP1基因表達(dá)量高的株系顏色遍布葉片整體,呈現(xiàn)出深紅色(圖3-B~D),表達(dá)量居中的株系呈現(xiàn)出淺紅色(圖3-F~H),而AtPAP1基因表達(dá)量低的株系只改變?nèi)~片局部位置

【參考文獻(xiàn)】

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【相似文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2562374