【摘要】：CRISPR-Cas9系統(tǒng)的發(fā)現(xiàn)和應(yīng)用為快速、定向的植物基因組編輯、突變體創(chuàng)制和開展植物功能基因組研究提供了新的技術(shù)工具。在本研究中,我們利用CRISPR-Cas9系統(tǒng),對水稻A類MADS-box轉(zhuǎn)錄基因Os MADS15進行定點基因組編輯。結(jié)果顯示,該體系在T_0代即獲得3個不同的9522~(Osmads15)雙等位突變株系:株系9522~(Osmads15-1)等位1在靶點缺失1個堿基A,等位2在靶點缺失3個堿基ACA;株系9522~(Osmads15-2)等位1在靶點缺失5個堿基CAACA,等位2在靶點缺失3個堿基CAA;株系9522~(Osmads15-3)等位1在靶點缺失1個堿基A;等位2發(fā)生了大片段的替換。所有株系等位1的突變均造成了開放閱讀框移碼,導(dǎo)致翻譯提前終止;等位2的突變也使氨基酸序列發(fā)生不同程度的變化。初步的表型分析顯示,9522~(Osmads15)突變體小穗不育外稃變長如葉狀,并表現(xiàn)出生殖生長向營養(yǎng)生長的轉(zhuǎn)變;與已報道的中秈3037~(dep)突變體表型不同,除9522~(Osmads15-2)株系外,其他2個株系內(nèi)稃及生殖器官也有向葉片轉(zhuǎn)換的趨勢。q RT-PCR分析顯示,3個突變株系的Os MADS15轉(zhuǎn)錄本水平顯著降低。因此,本研究對Os MADS15基因第一外顯子區(qū)域的靶點進行了高效的定點編輯,獲得的9522~(Osmads15)突變體為進一步開展OsMADS15調(diào)控水稻小穗發(fā)育的遺傳學(xué)和調(diào)控網(wǎng)絡(luò)研究提供了新的遺傳材料。
【圖文】：

體的表型觀察顯示,與前人的研究結(jié)果相似,9522Osmads15突變體營養(yǎng)期生長正常,僅在生殖生長期具有明顯的異常表型,所有9522Osmads15突變株系小穗均出現(xiàn)不同程度的異常發(fā)育性狀。野生型9522小穗生長于一次枝梗和二次枝梗上(圖3-A),外輪由不育外稃、外稃、內(nèi)稃組成,不育外稃短縮,外稃與內(nèi)稃緊密相扣(圖3-B)。而9522Osmads15-1突變體23.5%(4/17)分蘗的一次枝梗轉(zhuǎn)變?yōu)槿~狀器官(圖3-C),其上生長的小穗不育外稃細長如葉狀(圖3-D),13.6%(47/345)的小穗在基部有根狀結(jié)構(gòu)出現(xiàn)(圖3-D),這類小穗內(nèi)輪器官也發(fā)育異常,少量圖1OsMADS15基因結(jié)構(gòu)及pCH-M15構(gòu)建示意圖Fig.1SchematicdiagramofOsMADS15genestructureandpCH-M15vectorA:OsMADS15基因結(jié)構(gòu)及靶點位置。MADS:MADS-box結(jié)構(gòu)域;AGG:前間區(qū)序列鄰近基序(protospaceradjacentmotif,PAM);黑色線條為內(nèi)含子。B:pCH-M15(pBin-sgR-Cas-OsCH-OsMADS15-T1)載體。兩條直線位置即為靶序列插入位置。pOsU3:啟動sgRNA轉(zhuǎn)錄的U3啟動子;pOsUbi:水稻ubiquitin啟動子,用以啟動Cas9轉(zhuǎn)錄;NLS:核定位序列(nuclearlocalizationsequence);35S:啟動抗性基因轉(zhuǎn)錄的煙草35S啟動子;H+:潮霉素抗性基因;K+:卡那霉素抗性基因。

宋凡等:利用CRISPR-Cas9系統(tǒng)進行水稻OsMADS15基因的定向編輯973圖2水稻轉(zhuǎn)化植株的檢測及突變型分析Fig.2DetectionoftransgenicriceplantsandmutationvariantsA:pBin-sgR-Cas-OsCH載體元件的PCR檢測。M:Marker;1~4:載體元件存在的陽性植株;WT:元件不存在的野生型植株。B:9522Osmads15靶位點測序示意圖及3種突變情況。AGG表示PAM;D1、D3、D5分別表示缺失1、3、5個堿基;Osmads15-3(反向)表示OsMADS15R引物反向測序結(jié)果,TTGAAGCAA表示該序列與原序列不同。C:OsMADS15蛋白的4個結(jié)構(gòu)域(MADS、I、K、C)�；疑珯M虛線填充部分表示該段氨基酸序列與野生型不同;白色部分表示缺失。小穗心皮伸出內(nèi)外稃變成幼苗狀器官(圖3-E),多層稃狀結(jié)構(gòu)取代了內(nèi)輪的漿片、雄蕊和雌蕊器官(圖3-F)。另外,雖然此株系中內(nèi)稃結(jié)構(gòu)也出現(xiàn)異常,但與已報道的dep突變體表型不同,我們未在此株系內(nèi)發(fā)現(xiàn)內(nèi)稃退化現(xiàn)象,相反,突變體內(nèi)稃較外稃更長(圖3-E)。9522Osmads15-3株系小穗異常生長表型與9522Osmads15-1株系類似,小穗由葉/稃狀器官組成,且在基部有根狀器官著生,但器官長度小于9522Osmads15-1株系(圖3-G)。與9522Osmads15-1和9522Osmads15-3株系小穗表型不同,9522Osmads15-2株系小穗具有正常的內(nèi)輪漿片、雄蕊和雌蕊器官(圖3-H),但不育外稃和內(nèi)稃器官同樣更為細長;有趣的是,該株系中既有內(nèi)稃較外稃變長的小穗(圖3-H),也有內(nèi)稃退化的小穗(圖3-I),且在部分小穗內(nèi)稃和不育外稃之間出現(xiàn)一個額外的稃狀結(jié)構(gòu)(圖3-I)。OsMADS15基因轉(zhuǎn)錄水平分析顯示,在突變體株系的內(nèi)外稃組織中OsMADS15基因的轉(zhuǎn)錄水平顯著下降(圖3-J)。5突變植株9522Osmads15石蠟切片分析為了進一步觀察分析突變植株異常稃狀結(jié)構(gòu)的細胞學(xué)屬性,我們分別對3個株系進行了石蠟切片觀察

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1 李一凡;多元質(zhì)粒工程技術(shù)及CRISPR-Cas9介導(dǎo)的基因組編輯技術(shù)的建立與應(yīng)用[D];天津大學(xué);2015年

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本文編號：2560554