【摘要】：目的:篩選有效、特異性shRNA序列,使其能夠特異性沉默白血病細(xì)胞CDX2基因表達(dá),進(jìn)一步研究CDX2沉默表達(dá)聯(lián)合長(zhǎng)春新堿共同作用于白血病細(xì)胞時(shí),細(xì)胞增殖、凋亡的變化,并探討其可能的作用機(jī)制,探索靶向沉默CDX2基因聯(lián)合化療藥物治療白血病的新思路。方法:1.設(shè)計(jì)合成針對(duì)CDX2不同編碼區(qū)的4組CDX2-shRNA :CDX2-shRNA-1443, CDX2-shRNA-2008, CDX2-shRNA-921 和陰性對(duì)照序列CDX2-shRNA-NC,應(yīng)用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法分別轉(zhuǎn)染人結(jié)腸癌細(xì)胞株SW620,應(yīng)用Real-time PCR、Western-Blot法檢測(cè)各組shRNA轉(zhuǎn)染SW620細(xì)胞后,目的基因CDX2mRNA和蛋白的表達(dá)量變化,篩選出一組shRNA序列,使其對(duì)CDX2基因表達(dá)沉默效率最佳,進(jìn)一步通過(guò)細(xì)胞增殖、凋亡實(shí)驗(yàn)檢測(cè)轉(zhuǎn)染shRNA前后SW620細(xì)胞增殖、凋亡的變化,用于下一步實(shí)驗(yàn)。2.將篩選得到的CDX2-shRNA序列以及陰性對(duì)照序列分別轉(zhuǎn)染人慢性粒細(xì)胞白血病細(xì)胞株K562,通過(guò)Real-time PCR、Western-Blot法檢測(cè)轉(zhuǎn)染前后CDX2基因表達(dá)量變化,并進(jìn)一步檢測(cè)BCR-ABL、Caspase-9等凋亡關(guān)鍵蛋白的表達(dá)量變化;進(jìn)一步通過(guò)細(xì)胞增殖、凋亡實(shí)驗(yàn)檢測(cè),沉默CDX2基因表達(dá)后對(duì)白血病細(xì)胞增殖、凋亡的變化。3.將CDX2-shRNA與經(jīng)典化療藥物共同作用于白血病細(xì)胞,Real-time PCR、Western-Blot檢測(cè)CDX2基因表達(dá)量變化,進(jìn)一步檢測(cè)二者共同作用對(duì)白血病細(xì)胞增殖和凋亡的影響;同時(shí)檢測(cè)BCR-ABL、Caspase-9、Bax mRNA和蛋白的表達(dá)量變化,探討其可能的作用機(jī)制。結(jié)果:1.設(shè)計(jì)合成的4組CDX2-shRNA序列中,CDX2-shRNA-921抑制CDX2基因表達(dá)的效果最顯著,與正常細(xì)胞組相比,CDX2mRNA和蛋白表達(dá)量分別下降66.2% (P0.05)和68.2% (P0.01),差別均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;而陰性對(duì)照組CDX2 mRNA和蛋白表達(dá)量分別為0.720±0.084vs0.917±0.063,0.752±0.008vs0.798±0.013,差別均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;細(xì)胞增殖、凋亡實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:轉(zhuǎn)染CDX2-shRNA-921組細(xì)胞增殖抑制率在不同時(shí)間點(diǎn)均明顯高于正常細(xì)胞組,而細(xì)胞凋亡率為10.5%vs28.4%,差別均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。提示本研究成功篩選出對(duì)沉默CDX2基因表達(dá)沉默效率最佳的CDX2 shRNA序列,所合成陰性對(duì)照序列與人類基因組無(wú)同源性,可用于下一步實(shí)驗(yàn)。2.將CDX2-shRNA-921和陰性對(duì)照序列CDX2-shRNA-NC分別轉(zhuǎn)染人慢性粒細(xì)胞白血病細(xì)胞株K562后,CDX2基因表達(dá)量明顯降低,mRNA和蛋白表達(dá)量與正常細(xì)胞組相比分別下降60.5%和47.7%。進(jìn)一步檢測(cè)相關(guān)凋亡蛋白可知,沉默CDX2基因表達(dá)后,Survivin表達(dá)量明顯降低,Caspase-9、Bax的表達(dá)量明顯增高。轉(zhuǎn)染CDX2-shRNA-921組細(xì)胞增殖抑制率和凋亡率較正常細(xì)胞組和轉(zhuǎn)染CDX2-shRNA-NC組明顯增加。3.將CDX2-shRNA-921與長(zhǎng)春新堿(VCR)聯(lián)合作用于K562細(xì)胞,MTT法和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞增殖、凋亡情況可知,CDX2-shRNA-921+VCR聯(lián)合作用組與細(xì)胞對(duì)照組、陰性對(duì)照細(xì)胞組、VCR組和CDX2-shRNA-921組的細(xì)胞增殖抑制率、凋亡率差異比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論:1.實(shí)驗(yàn)篩選的CDX2-shRNA序列能夠有效沉默CDX2基因表達(dá),也能使人結(jié)腸癌細(xì)胞SW620增殖受抑、凋亡增加。2.實(shí)驗(yàn)篩選的CDX2-shRNA序列在白血病細(xì)胞中同樣存在類似作用,能夠有效沉默白血病細(xì)胞K562內(nèi)CDX2基因表達(dá),同時(shí)能夠顯著抑制K562細(xì)胞增殖并促進(jìn)凋亡,其機(jī)制可能是激活細(xì)胞內(nèi)多種與凋亡相關(guān)的信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)的。3.轉(zhuǎn)染CDX2-shRNA載體聯(lián)合長(zhǎng)春新堿后,K562細(xì)胞的增殖能力減弱,凋亡率顯著增加,即沉默CDX2基因表達(dá)后,K562細(xì)胞對(duì)長(zhǎng)春新堿的藥物敏感性顯著增強(qiáng)。
【圖文】：

蛋白表達(dá)量下降最為顯著（６８％），差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Ｐ＜０．００１），逡逑ＣＤＸ２－ｓｈＲＮＡ－ＮＣ組ＣＤＸ２蛋白表達(dá)量（０．７５２±０．００８）與未轉(zhuǎn)染細(xì)胞組逡逑（０．７９８±０．０１３）比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，Ｐ＞０．０５。見(jiàn)圖１－２。本結(jié)果與逡逑Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ邋ＰＣＲ結(jié)果相符，提示本實(shí)驗(yàn)成功篩選出能夠特異性有效沉默逡逑ＳＷ６２０細(xì)胞ＣＤＸ２基因表達(dá)的ｓｈＲＮＡ序列

灄邋ｉｉＪｌ逡逑，／邐＃令０七逡逑圖１－２邋Ｗｅｓｔｅｒｎ邋Ｂｌｏｔ法檢測(cè)各處理組ＣＤＸ２蛋白表達(dá)水平變化逡逑Ｆｉｇ．邋１－１邋Ｔｈｅ邋ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ邋ｏｆ邋ＣＤＸ２邋ｐｒｏｔｅｉｎ邋ｉｎ邋ｅａｃｈ邋ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ邋ｇｒｏｕｐ邋ｄｅｔｅｃｔｅｄ邋ｂｙ逡逑Ｗｅｓｔｅｒｎ邋Ｂｌｏｔ逡逑Ｆｉｇ．邋１－２：邋Ｔｈｅ邋ｒｅｌａｔｉｖｅ邋ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ邋ｏｆ邋ＣＤＸ２邋ｐｒｏｔｅｉｎ邋ｉｎ邋Ｋ５６２邋ｃｅｌｌｓ邋ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ邋ｗｉｔｈ邋ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ逡逑ｓｈＲＮＡｓ（ｄｅｔｅｃｔｅｄ邋ｂｙ邋Ｗｅｓｔｅｒｎ邋Ｂｌｏｔ）．邋１４４３：邋Ｋ５６２邋ｃｅｌｌｓ邋ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ邋ｗｉｔｈ逡逑ＣＤＸ２－ｓｈＲＮＡ－１４４３；邋２００９：邋Ｋ５６２邋ｃｅｌｌｓ邋ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ邋ｗｉｔｈ邋ＣＤＸ２－ｓｈＲＮＡ－２００９；邋９２１：邋Ｋ５６２逡逑ｃｅｌｌｓ邋ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ邋ｗｉｔｈ邋ＣＤＸ２－ｓｈＲＮＡ－９２１；邋ＮＣ：邋Ｋ５６２邋ｃｅｌｌｓ邋ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ邋ｗｉｔｈ逡逑ＣＤＸ２－ｓｈＲＮＡ－ＮＣ邋ａｓ邋ａ邋ｎｅｇａｔｉｖｅ邋ｃｏｎｔｒｏｌ；邋Ｋ：邋Ｕｎｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ邋Ｋ５６２邋ｃｅｌｌｓ邋ａｓ邋ａ邋ｂｌａｎｋ邋ｃｏｎｔｒｏｌ．逡逑＊＊＊：邋Ｐ＜０．００５，邋ｃｏｍｐａｒｅｄ邋ｗｉｔｈ邋ｂｌａｎｋ邋ｃｏｎｔｒｏｌ邋ｇｒｏｕｐ．逡逑１．３．３邋ＣＤＸ２邋ｓｈＲＮＡ對(duì)ＳＶ／６２０細(xì)胞增殖育ｇ力的影響逡逑ＭＴＴ結(jié)果顯示：與ＣＤＸ２－ｓｈＲＮＡ－ＮＣ組和正常細(xì)胞組比較，轉(zhuǎn)染６ｈ，，逡逑１２ｈ、１８ｈ、３６ｈ、５４ｈ、７２ｈ，轉(zhuǎn)染ＣＤＸ２－ｓｈＲＮＡ－９２１組細(xì)胞增殖能力明顯減逡逑弱
【學(xué)位授予單位】：濱州醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R733.7

【參考文獻(xiàn)】

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1 裴衛(wèi)z

本文編號(hào)：2554168