【摘要】：本研究對(duì)菘藍(lán)CYP83A1基因進(jìn)行了克隆、表達(dá)特性及原核表達(dá)研究。結(jié)果表明,IiCYP83A1基因組DNA全長(zhǎng)為1 622 bp,包含2個(gè)外顯子和1個(gè)內(nèi)含子;cDNA全長(zhǎng)為1 512 bp,編碼503個(gè)氨基酸。IiCYP83A1編碼的蛋白包含2個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域,無(wú)信號(hào)肽,主要定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜,屬于親水性蛋白,二級(jí)結(jié)構(gòu)主要由α-螺旋和無(wú)規(guī)則卷曲組成,與蘿卜、歐洲油菜、西蘭花和蕪菁等植物的CYP83A1蛋白具有較高的同源性。qRT-PCR結(jié)果表明,IiCYP83A1在不同組織中的表達(dá)具有顯著性差異,表現(xiàn)為莖葉果花和根;在幼苗期、生長(zhǎng)期和花期的表達(dá)量顯著高于萌芽期;茉莉酸甲酯(MeJA)和傷害處理能夠顯著促進(jìn)該基因的表達(dá),而低溫(4℃)和水楊酸(SA)處理則對(duì)其表達(dá)具有一定的抑制作用。將克隆到的IiCYP83A1基因連接到表達(dá)載體pET-28a上,構(gòu)建原核表達(dá)載體pET-28a-IiCYP83A1并對(duì)其進(jìn)行原核表達(dá)。SDS-PAGE結(jié)果顯示,在E.coli BL21中成功誘導(dǎo)表達(dá)了CYP83A1蛋白,與預(yù)期蛋白分子量大小一致。本研究結(jié)果可為進(jìn)一步研究IiCYP83A1的功能提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
【圖文】：

軟件預(yù)測(cè)IiCYP83A1蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)，結(jié)果表明該蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)中α-螺旋(alphhahelix)所占比例為46.52%，無(wú)規(guī)則卷曲螺旋(randomcoil)所占比例為31.41%，而延伸鏈(extendedstrand)所占比例為12.72%，β-轉(zhuǎn)角(β-turn)所占比例為9.34%。因此，α-螺旋和無(wú)規(guī)則卷曲螺旋是I-iCYP83A1的主要結(jié)構(gòu)元件，而延伸鏈分布在整個(gè)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中。利用SwissModel程序同源構(gòu)建模型預(yù)測(cè)該蛋白的三維結(jié)構(gòu)模型(圖4)，IiCYP83A1三級(jí)結(jié)構(gòu)中α-螺旋和無(wú)規(guī)則卷曲所占比例較高，其次為延伸鏈，與其二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)的結(jié)果相一致。圖3IiCYP83A1蛋白的功能結(jié)構(gòu)域Figure3FunctionaldomainanalysisofIiCYP83A11.5IiCYP83A1同源蛋白的多序列比對(duì)及系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)利用NCBI中的BLASTP程序，分析IiCYP83A1與其他植物CYP83A1的氨基酸同源性。結(jié)果表明：菘藍(lán)CYP83A1氨基酸序列與蕪菁(Brassicarapa,XP_009139598.1)、歐洲油菜(Brassicanapus,NP_001-303017.1)、西蘭花(Brassicaoleracea,AIK28472.1)和蘿卜(Raphanussativus,AHB11194.1)的氨基酸序列相似性均為95%；與芥菜(Brassica_juncea,AGO377-57.1)、深山擬南芥(Arabidopsislyrata,XP_0028683-39.1)、擬南芥(Arabidopsisthaliana,NP_193113.1)及天藍(lán)遏藍(lán)菜(Noccaeacaerulescens,JAU56242.1)的氨基酸序列相似性分別為92%、87%、87%和85%。多序列比對(duì)結(jié)果表明：菘藍(lán)CYP83A1與其他8種植物的CYP83A1結(jié)構(gòu)類似，均具有保守的血紅素結(jié)合域(Heme-bindingmotif,FxxGxRxCxG序列)和氧結(jié)合域(A/G)Gx(D/E)T(T/S)，并含有兩個(gè)P450s的標(biāo)志性序列：PERF和KETLR(K-helix)(圖5)。此外，利用ClustalX1.8和MEGA5.0對(duì)IiCYP83A1氨基酸序列與GenBank上注冊(cè)的其他物種CYP83A1的氨基

發(fā)育階段的表達(dá)特性。結(jié)果顯示：IiCYP83A1在菘藍(lán)的根、莖、葉、花和果中均有表達(dá)，且以莖中表達(dá)量最高，為根中表達(dá)量的64倍，其次是葉和果，分別是根中表達(dá)量的41和24倍，而根和花中表達(dá)量較低(圖7A)。IiCYP83A1在菘藍(lán)幼苗期、生長(zhǎng)期和花期均有表達(dá)，且顯著高于萌芽期(圖7B)。為了探究IiCYP83A1在逆境脅迫下的表達(dá)特性，本研究利用qRT-PCR分析了4種非生物脅迫(MeJA,SA,低溫和傷害)處理下菘藍(lán)幼苗中IiCYP8-3A1的表達(dá)模式。結(jié)果顯示，，在MeJA處理?xiàng)l件下(圖7C)，IiCYP83A1表達(dá)量伴隨處理時(shí)間的延長(zhǎng)呈圖4IiCYP83A1蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Figure4Predicted3DstructuremodelofIiCYP83A1305

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本文編號(hào)：2554002