【摘要】：煙草翻譯起始因子家族成員eIF4E-6(Ntab0942120)與馬鈴薯Y病毒VPg互作決定著PVY對(duì)煙草的侵染進(jìn)程,為打斷PVY對(duì)煙草細(xì)胞的侵染途徑,增強(qiáng)煙株自身對(duì)PVY的抗性,本研究應(yīng)用TALENs技術(shù),對(duì)煙草eIF4E-6基因進(jìn)行了靶向修飾。1.eIF4E-6基因TALENs表達(dá)載體的構(gòu)建綜合eIF4E-6與煙草eIF4E家族成員序列比對(duì)和TALEN Targeter在線軟件設(shè)計(jì)TALENs靶序列,進(jìn)行TALEN模塊組裝構(gòu)建TALENs表達(dá)載體,利用Luciferase SSA報(bào)告載體法進(jìn)行TALENs活性評(píng)價(jià),獲得體外DNA剪切活性較為理想的兩個(gè)TALENs表達(dá)載體T3和T4,構(gòu)建TALEN敲除載體并用電擊法導(dǎo)入LBA4404感受態(tài)細(xì)胞制備工程菌。2.轉(zhuǎn)化煙草采用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉盤法,轉(zhuǎn)化易感PVY的煙草品種K326,并對(duì)轉(zhuǎn)化苗進(jìn)行潮霉素B抗性基因的PCR檢測(cè),分別獲得了T3和T4 TALENs表達(dá)載體的T0代陽(yáng)性轉(zhuǎn)化煙株40和50株。3.eIF4E-6基因突變位點(diǎn)的檢測(cè)陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子DNA進(jìn)行eIF4E-6基因的PCR擴(kuò)增,擴(kuò)增產(chǎn)物連入T載體克隆測(cè)序,經(jīng)序列比對(duì),T0代群體中,表達(dá)載體T3獲得靶位點(diǎn)大片段堿基缺失突變型1株、靶位點(diǎn)堿基替換突變型3株。表達(dá)載體T4獲得靶位點(diǎn)堿基替換突變型5株。4.突變材料的抗性分析接種PVY后突變材料癥狀較野生對(duì)照有所減輕,Real Time RT-PCR檢測(cè)結(jié)果表明突變株的eIF4E-6基因表達(dá)量與病毒量均低于非轉(zhuǎn)基因K326煙株。5.突變材料的生理生化分析接種PVY后,煙株體內(nèi)酶活性檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)各突變型T0代煙株的PAL、POD和SOD活性與野生型K326煙株相比有不同程度的升高。
【圖文】：

圖 1-2 PVY 病毒 VPg 與寄主 eIF4E 的互作模型Fig.1-2 The interaction of VPg from PVY and eIF4E of host 與 PVY 抗病相關(guān)性寄主植物細(xì)胞的侵染和增殖需要依賴寄主代謝系統(tǒng)提供提供病毒致病必備的條件，阻礙病毒的侵染，寄主植物從抗病植物種質(zhì)中定位了多種抗病毒基因，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)來(lái)r21，pvr22 和 pvr6[18,20]，來(lái)源于擬南芥的 Ispl[21]和來(lái)源豌豆種傳花葉病毒（PSbMV）抗性基因 sbml，sbm2 等[編碼 eIF4E 和 eIF(iso)4E。RNA 與 elF4E 結(jié)合是通過(guò) 5′ 帽子結(jié)構(gòu)，但 PVY 基因組構(gòu)，現(xiàn)已證實(shí)共價(jià)結(jié)合 VPg 蛋白充當(dāng)了其替代物。酵

EN 基因定點(diǎn)改造技術(shù)LEN 的結(jié)構(gòu)與原理s 是由黃單胞桿菌分泌的一種蛋白，該蛋白由 N 端、DNA 結(jié)構(gòu)域及 C 端 4 個(gè)部分組成（見圖 1-3a）。研究發(fā)現(xiàn)：不同的NA 結(jié)合域含有數(shù)個(gè)氨基酸組成高度保守的重復(fù)單元，每個(gè)基酸組成，其中只有第 12、13 位氨基酸可以改變，稱作雙Repeat variable di-residue，RVD）[31]。Moscou[32]和 Boch[33]等基識(shí)別規(guī)律，，為 TALEN 技術(shù)的發(fā)展奠定了基礎(chǔ)。Mahfouz[34]和床黃桿菌的一種限制性內(nèi)切酶 FokI 替換了 TALEs 蛋白 一次得到效率較高的人工核酸酶 TALEN（見圖 1-3b），可用目前 TALENs 系統(tǒng)已日益成熟。
【學(xué)位授予單位】：牡丹江師范學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：Q943.2

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2551569