【摘要】：研究背景：血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子A (Vascular endothelial growth factor A, VEGF)在生理和病理血管化中均發(fā)揮著關(guān)鍵作用。人VEGF基因位于染色體6p21.3,由8個(gè)外顯子構(gòu)成,其中第6、7和8外顯子具有有近端剪接位點(diǎn)和遠(yuǎn)端剪接位點(diǎn),并因5’和3'端剪接位點(diǎn)的選擇性差異產(chǎn)生了多種形式的VEGF剪接變異體。根據(jù)第8外顯子的剪接情況,可以將VEGF的剪接變異體分為兩個(gè)活性截然相反的亞家族,其中VEGFxxx亞家族成員使用近端剪接位點(diǎn),具有促血管生成活性,而VEGFxxxb亞家族成員使用遠(yuǎn)端剪接位點(diǎn),具有抗血管生成活性。大量研究證實(shí),VEGF165、VEGF189和VEGF 121等VEGFxxx亞家族成員能夠通過促進(jìn)創(chuàng)面組織血管化加速多種類型創(chuàng)面的愈合過程。然而,VEGFxxxb亞家族成員是否參與創(chuàng)面愈合過程并能影響創(chuàng)面轉(zhuǎn)歸仍未知曉。最新研究發(fā)現(xiàn)了兩個(gè)具有抵抗纖溶酶和基質(zhì)金屬蛋白酶降解的VEGF剪接變異體VEGF111和VEGF111b,但目前對(duì)VEGF111b血管生成活性的報(bào)道卻存在爭(zhēng)議。研究目標(biāo)：為了初步揭示VEGF111b的生物學(xué)活性及其對(duì)創(chuàng)面愈合的影響,本研究使用小鼠皮膚全層缺損模型系統(tǒng)比較了VEGF111和VEGF111b基因治療的效果。方法和結(jié)果：以人乳腺癌MCF7細(xì)胞總RNA為模板進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增VEGF111和VEGF111bcDNA,分別亞克隆至pIRES2-EGFP獲得真核表達(dá)載體pIRES2-VEGF111和pIRES2-VEGF111b,并經(jīng)DNA測(cè)序加以證實(shí)。使用二氧化硅吸附法大量提取質(zhì)粒,并使用Triton X-114等溫相分離法去除質(zhì)粒樣品中的內(nèi)毒素。將40只8周齡C57/6J小鼠隨機(jī)分為空白對(duì)照組、PluronicF127對(duì)照組、pIRES2-EGFP對(duì)照組、pIRES2-VEGF111治療組和pIRES2-VEGF111b治療組。腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉小鼠后,脫毛并消毒術(shù)區(qū),使用皮膚活檢針在小鼠背部正中線兩側(cè)分別做一直徑6mm的全層缺損,用內(nèi)徑7mm的環(huán)形硅膠膜固定傷口周圍皮膚以對(duì)抗皮膚收縮,在傷口內(nèi)滴加包裹有PEI-質(zhì)粒DNA復(fù)合物的Pluronic F127水凝膠,凡士林紗布覆蓋,用自粘彈性繃帶包扎,分別于3d、5d和7d時(shí)照相并取材進(jìn)行HE和Masson染色分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：VEGF111和VEGF111b均能顯著促進(jìn)創(chuàng)面愈合,在7d時(shí)兩組創(chuàng)面基本上完全愈合,而三個(gè)對(duì)照組未愈創(chuàng)面面積仍都在初始創(chuàng)面面積的50%以上。盡管在3d時(shí),VEGF111組和VEGF111b組之間的創(chuàng)面愈合存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,但在5d時(shí)這種差異消失。創(chuàng)面組織微血管計(jì)數(shù)分析表明與空白對(duì)照組和F-127組相比,pIRES2-EGFP組在5d時(shí)創(chuàng)面局部微血管數(shù)量顯著增多(P0.001),提示PEI-質(zhì)粒的摻入能夠促進(jìn)血管化。同時(shí),VEGF111組和VEGF111b組與pIRES2組相比差異非常顯著(P0.001)。然而,VEGF111組和VEGF111b組相比在各時(shí)間點(diǎn)微血管數(shù)量無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05),表明VEGF111和VEGF111b在體內(nèi)具有相同的促組織血管化能力。對(duì)創(chuàng)面組織進(jìn)行HE染色分析發(fā)現(xiàn),在5d時(shí),空白對(duì)照組、F127組和pIRES2組的表皮組織均明顯向創(chuàng)面中央爬行,至7d時(shí)兩翼表皮組織仍未匯合。然而,VEGF111組和VEGF111b組在5d時(shí)表皮組織已經(jīng)完全覆蓋創(chuàng)面,表明VEGF111和VEGF111b具有較強(qiáng)的促再上皮化作用。對(duì)創(chuàng)面組織進(jìn)行Masson染色分析發(fā)現(xiàn),在7d時(shí)空白對(duì)照組、F127組和pIRES2組的創(chuàng)面組織內(nèi)富含大量藍(lán)染的膠原纖維,而VEGF111組和VEGF111b組則藍(lán)染區(qū)域較少,提示VEGF111和VEGF111b均能夠抑制膠原纖維沉積。值得一提的是,在5d時(shí)VEGF111b組的表皮組織就開始出現(xiàn)內(nèi)陷并形成毛囊樣結(jié)構(gòu),在7d時(shí)毛囊樣結(jié)構(gòu)數(shù)量明顯增多,提示VEGF111b可能具有誘導(dǎo)無疤愈合能力。結(jié)論：本研究通過系統(tǒng)比較VEGF111和VEGF111b基因治療對(duì)小鼠皮膚全層缺損模型的治療作用,證實(shí)了在體條件下VEGF111b具有與VEGF111相當(dāng)?shù)拇傺苄律饔�。同時(shí)證實(shí),VEGF111和VEGF111b基因治療能通過加速再上皮化和增強(qiáng)組織血管化機(jī)制顯著促進(jìn)皮膚組織缺損的修復(fù)。此外,我們首次發(fā)現(xiàn)VEGF111b能夠在治療早期引發(fā)表皮層向真皮下陷并形成毛囊樣結(jié)構(gòu),提示過表達(dá)VEGF111b能誘導(dǎo)缺損組織的再生性修復(fù)。
【圖文】：

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【學(xué)位授予單位】：西北大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R450;R641

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本文編號(hào)：2550660