【摘要】：研究背景：血管內(nèi)皮生長因子A (Vascular endothelial growth factor A, VEGF)在生理和病理血管化中均發(fā)揮著關鍵作用。人VEGF基因位于染色體6p21.3,由8個外顯子構成,其中第6、7和8外顯子具有有近端剪接位點和遠端剪接位點,并因5’和3'端剪接位點的選擇性差異產(chǎn)生了多種形式的VEGF剪接變異體。根據(jù)第8外顯子的剪接情況,可以將VEGF的剪接變異體分為兩個活性截然相反的亞家族,其中VEGFxxx亞家族成員使用近端剪接位點,具有促血管生成活性,而VEGFxxxb亞家族成員使用遠端剪接位點,具有抗血管生成活性。大量研究證實,VEGF165、VEGF189和VEGF 121等VEGFxxx亞家族成員能夠通過促進創(chuàng)面組織血管化加速多種類型創(chuàng)面的愈合過程。然而,VEGFxxxb亞家族成員是否參與創(chuàng)面愈合過程并能影響創(chuàng)面轉歸仍未知曉。最新研究發(fā)現(xiàn)了兩個具有抵抗纖溶酶和基質(zhì)金屬蛋白酶降解的VEGF剪接變異體VEGF111和VEGF111b,但目前對VEGF111b血管生成活性的報道卻存在爭議。研究目標：為了初步揭示VEGF111b的生物學活性及其對創(chuàng)面愈合的影響,本研究使用小鼠皮膚全層缺損模型系統(tǒng)比較了VEGF111和VEGF111b基因治療的效果。方法和結果：以人乳腺癌MCF7細胞總RNA為模板進行RT-PCR擴增VEGF111和VEGF111bcDNA,分別亞克隆至pIRES2-EGFP獲得真核表達載體pIRES2-VEGF111和pIRES2-VEGF111b,并經(jīng)DNA測序加以證實。使用二氧化硅吸附法大量提取質(zhì)粒,并使用Triton X-114等溫相分離法去除質(zhì)粒樣品中的內(nèi)毒素。將40只8周齡C57/6J小鼠隨機分為空白對照組、PluronicF127對照組、pIRES2-EGFP對照組、pIRES2-VEGF111治療組和pIRES2-VEGF111b治療組。腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉小鼠后,脫毛并消毒術區(qū),使用皮膚活檢針在小鼠背部正中線兩側分別做一直徑6mm的全層缺損,用內(nèi)徑7mm的環(huán)形硅膠膜固定傷口周圍皮膚以對抗皮膚收縮,在傷口內(nèi)滴加包裹有PEI-質(zhì)粒DNA復合物的Pluronic F127水凝膠,凡士林紗布覆蓋,用自粘彈性繃帶包扎,分別于3d、5d和7d時照相并取材進行HE和Masson染色分析。結果發(fā)現(xiàn)：VEGF111和VEGF111b均能顯著促進創(chuàng)面愈合,在7d時兩組創(chuàng)面基本上完全愈合,而三個對照組未愈創(chuàng)面面積仍都在初始創(chuàng)面面積的50%以上。盡管在3d時,VEGF111組和VEGF111b組之間的創(chuàng)面愈合存在統(tǒng)計學差異,但在5d時這種差異消失。創(chuàng)面組織微血管計數(shù)分析表明與空白對照組和F-127組相比,pIRES2-EGFP組在5d時創(chuàng)面局部微血管數(shù)量顯著增多(P0.001),提示PEI-質(zhì)粒的摻入能夠促進血管化。同時,VEGF111組和VEGF111b組與pIRES2組相比差異非常顯著(P0.001)。然而,VEGF111組和VEGF111b組相比在各時間點微血管數(shù)量無統(tǒng)計學差異(P0.05),表明VEGF111和VEGF111b在體內(nèi)具有相同的促組織血管化能力。對創(chuàng)面組織進行HE染色分析發(fā)現(xiàn),在5d時,空白對照組、F127組和pIRES2組的表皮組織均明顯向創(chuàng)面中央爬行,至7d時兩翼表皮組織仍未匯合。然而,VEGF111組和VEGF111b組在5d時表皮組織已經(jīng)完全覆蓋創(chuàng)面,表明VEGF111和VEGF111b具有較強的促再上皮化作用。對創(chuàng)面組織進行Masson染色分析發(fā)現(xiàn),在7d時空白對照組、F127組和pIRES2組的創(chuàng)面組織內(nèi)富含大量藍染的膠原纖維,而VEGF111組和VEGF111b組則藍染區(qū)域較少,提示VEGF111和VEGF111b均能夠抑制膠原纖維沉積。值得一提的是,在5d時VEGF111b組的表皮組織就開始出現(xiàn)內(nèi)陷并形成毛囊樣結構,在7d時毛囊樣結構數(shù)量明顯增多,提示VEGF111b可能具有誘導無疤愈合能力。結論：本研究通過系統(tǒng)比較VEGF111和VEGF111b基因治療對小鼠皮膚全層缺損模型的治療作用,證實了在體條件下VEGF111b具有與VEGF111相當?shù)拇傺苄律饔�。同時證實,VEGF111和VEGF111b基因治療能通過加速再上皮化和增強組織血管化機制顯著促進皮膚組織缺損的修復。此外,我們首次發(fā)現(xiàn)VEGF111b能夠在治療早期引發(fā)表皮層向真皮下陷并形成毛囊樣結構,提示過表達VEGF111b能誘導缺損組織的再生性修復。
【圖文】：

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【學位授予單位】：西北大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R450;R641

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本文編號：2550660