【摘要】：主要探討了在黑麥草屬植物中導(dǎo)入高羊茅S-腺苷甲硫氨酸脫羧酶基因(FaSAMDC)對(duì)轉(zhuǎn)基因植株抗旱耐熱性的提高效果,為培育黑麥草抗旱耐熱新品種提供種質(zhì)新材料。選擇黑麥草成熟種子為外植體,采用貴州省草業(yè)研究所分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的過(guò)表達(dá)載體以及黑麥草胚性愈傷組織高頻植株再生和農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化體系,將克隆自高羊茅的FaSAMDC基因轉(zhuǎn)入貴州地區(qū)主栽品種多花黑麥草特高和多年生黑麥草四季的基因組內(nèi),經(jīng)抗性篩選、PCR檢測(cè)和Southern雜交分析驗(yàn)證,獲得45株特高與44株四季的轉(zhuǎn)基因植株,轉(zhuǎn)化頻率分別為2.93%和2.28%。抗旱耐熱試驗(yàn)表明,在30℃高溫和中度干旱脅迫條件下,特高轉(zhuǎn)基因株系的根冠比比對(duì)照組培苗高出7.08%,葉片相對(duì)含水量(RWC)比對(duì)照高出13.12%,RWC降低幅度比對(duì)照少5.49個(gè)百分點(diǎn);四季轉(zhuǎn)基因株系的根冠比比對(duì)照組培苗高出6.54%,RWC比對(duì)照高出12.54%,RWC降低幅度比對(duì)照少6.50個(gè)百分點(diǎn),差異均達(dá)到顯著水平(P0.05),證明轉(zhuǎn)入FaSAMDC基因的黑麥草陽(yáng)性株系的抗旱耐熱能力得到了明顯提高。形態(tài)與生長(zhǎng)特征觀測(cè)結(jié)果顯示,與非轉(zhuǎn)基因組培苗相比,轉(zhuǎn)基因株系的葉長(zhǎng)、株高、主莖節(jié)數(shù)減小,葉寬、單株分蘗數(shù)增加,葉色變深,植株形狀趨向于葉片叢生的緊湊型,推測(cè)導(dǎo)入的FaSAMDC基因參與了基因表達(dá)、細(xì)胞分裂等生理功能的調(diào)節(jié)。
【圖文】：

的轉(zhuǎn)基因植株。1材料與方法1．1材料黑麥草外植體選用在貴州地區(qū)種植較為普遍的品種的成熟種子，一年生黑麥草特高于2014年購(gòu)于貴陽(yáng)霖卉園林綠化有限公司，多年生黑麥草四季由貴州省草業(yè)研究所保存。2013至2014年構(gòu)建的過(guò)表達(dá)載體是由經(jīng)貴州省草業(yè)研究所分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室改造過(guò)的植物表達(dá)載體pCAMBIA1300與克隆自高羊茅黔草1號(hào)的SAMDC基因(FaSAMDC)所形成的重組質(zhì)粒pCAMBIA1300-FaSAMDC。該載體具有潮霉素(hygromycin，Hyg)和卡那霉素(kanamycin，Kan)抗性，在FaSAMDC片段的兩側(cè)各具有一個(gè)CaMV35S啟動(dòng)子，主要表達(dá)框架如圖1所示。通過(guò)凍融法將重組質(zhì)粒導(dǎo)入根癌農(nóng)桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)菌株EHA105和GV3101中，經(jīng)PCＲ和酶切驗(yàn)證獲得陽(yáng)性克隆［14］。圖1構(gòu)建的過(guò)表達(dá)載體結(jié)構(gòu)圖Fig．1SchematicicdiagramofconstructedrecombinantplasmidLB:左邊界Leftborder;CaMVpoly(A):來(lái)自花椰菜花葉病毒35S啟動(dòng)子的多聚腺苷酸尾Polyadenylationfrom35Spromoterofcauliflowermosaicvirus;HYG:抗潮霉素序列Hygromycinresistantsequence;XhoI:限制性?xún)?nèi)切酶XhoI識(shí)別序列SequencerecognizedbyrestrictionenzymeXhoI;CaMV35Spromot-er1:來(lái)自花椰菜花葉病毒的35S啟動(dòng)子135Spromoter1fromcauliflowermosaicvirus;EcoＲI:限制性?xún)?nèi)切酶EcoＲI識(shí)別序列Sequencerecognizedbyre-strictionenzymeEcoＲI;NsiI:限制性?xún)?nèi)切酶NsiI識(shí)別序列SequencerecognizedbyrestrictionenzymeNsiI;SphI:限制性?xún)?nèi)切酶SphI識(shí)別序列Sequencerec-ognizedbyrestrictionenzymeSphI;PstI:限制性?xún)?nèi)切酶PstI識(shí)別序列SequencerecognizedbyrestrictionenzymePstI;FaSAMDC:插入的高羊茅腺苷甲硫氨酸脫羧酶基因InsertedS-adenosylmethioninedecarboxylasegenefromFestucaarundinacea;

中特高轉(zhuǎn)基因株系比對(duì)照苗高出7．08%，四季轉(zhuǎn)基因株系比對(duì)照高出6．54%，，差異均達(dá)到顯著水平(P＜0．05)。圖2農(nóng)桿菌介導(dǎo)的黑麥草遺傳轉(zhuǎn)化及植株再生Fig．2Agrobacterium-mediatedtransformationofryegrassandregenerationofthetransformedplantletsA:誘導(dǎo)出的特高胚性愈傷組織;B:特高胚性愈傷組織與根癌農(nóng)桿菌的共培養(yǎng);C:四季抗性愈傷組織不定芽的分化;D:生根培養(yǎng)基中特高和四季抗性植株生根;E:特高和四季抗性植株移栽至花缽并成活;F:特高和四季抗性植株在人工氣候室內(nèi)生長(zhǎng)。A:InducedembryogeniccallusofTetragold;B:Co-cultureofembryogeniccallusofTetragoldandAgrobacteriumtumefaciens;C:DifferentiationofadventitiousbudsfromresistantcallusofFourseasons;D:Hygromycin-resistantplantsofTetragoldandFourseasonsgrowinginrootingmedium;E:Hygromycin-resistantplantsofTetragoldandFourseasonspottedinsoilsuccessfully;F:Hygromycin-resistantplantsofTetragoldandFourseasonsgrowinginclimaticlaboratory．圖3轉(zhuǎn)基因黑麥草抗性植株潮霉素B基因的PCＲ檢測(cè)Fig．3PCＲanalysisofBgeneofhygromycininputativetransgenicplantsofryegrassM:DNA分子量;+:EHA105-p1300菌(陽(yáng)性對(duì)照);－:非轉(zhuǎn)化植株(陰性對(duì)照);1～9:特高和四季轉(zhuǎn)基因抗性植株。M:DNAmarker;+:StrainEHA105-p1300aspositivecontrol;－:Non-transformedplantasnegativecontrol;1－9:Transgenichygromycin-resistantplantsofTetragoldandFoursea-sons．表1農(nóng)桿菌介導(dǎo)2個(gè)黑麥草品種的轉(zhuǎn)化頻率Table1TransgenicfrequencyoftworyegrasscultivarsbyAgrobacteriumtumefaciens特高Tetragold轉(zhuǎn)化愈傷組織數(shù)No．ofcallitransformed抗性?
【作者單位】： 貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院草業(yè)研究所;
【基金】：貴州省農(nóng)業(yè)科技攻關(guān)項(xiàng)目(黔科合NY[2013]3060號(hào)) 貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院博士科研啟動(dòng)基金(2013-06) 黔農(nóng)科院自主創(chuàng)新科研專(zhuān)項(xiàng)[(2014)010號(hào)] 貴州省高層次創(chuàng)新型人才培養(yǎng)項(xiàng)目(黔科合人才[2016]4024) 貴州省科技創(chuàng)新人才團(tuán)隊(duì)建設(shè)項(xiàng)目(黔科合平臺(tái)人才[2016]5617)資助
【分類(lèi)號(hào)】：S543.6

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本文編號(hào)：2548627