【摘要】：傳染性造血器官壞死病病毒(Infectious haematopoietic necrosis virus,IHNV)屬于彈狀病毒科(Rhabdoviridae),諾拉彈狀病毒屬(Novirhabdovirus),是傳染性造血器官壞死病(Infectious haematopoietic necrosis,IHN)的病原;該病毒所引起的IHN是以野生或人工養(yǎng)殖的少年鮭魚造血組織和其他內(nèi)臟器官的出血壞死為主要特征的急性、全身性、致死性的疾病;并且IHN是危害水產(chǎn)養(yǎng)殖鮭魚類的一種非常重要的病毒性疾病,具有較強(qiáng)的致病性和高度傳染性,該病依據(jù)魚的種類和大小,毒株和環(huán)境因素的不同,致死率也有所不同,嚴(yán)重時(shí)可達(dá)100%,在世界范圍內(nèi)的水產(chǎn)養(yǎng)殖行業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。我國甘肅省也是IHNV的流行之地;在甘肅省蘭州市永登縣某虹鱒魚(Oncorhynchus mykiss)養(yǎng)殖場(chǎng)采疑似IHNV的病魚數(shù)條,做以下試驗(yàn):(1)將所采病料進(jìn)行IHNV的分離培養(yǎng)、RT-PCR鑒定、同源性和遺傳進(jìn)化分析。結(jié)果顯示,病料經(jīng)研磨過濾除菌的懸液接種鯉魚上皮瘤細(xì)胞(Endothelial progenitor cell,EPC)出現(xiàn)典型的細(xì)胞病變效應(yīng)(Cytopathic effect,CPE),對(duì)該病毒的N基因進(jìn)行特異性的擴(kuò)增,擴(kuò)增出了預(yù)期的1,408bp大小的片段;對(duì)擴(kuò)增出的片段測(cè)序后進(jìn)行同源性比較和系統(tǒng)進(jìn)化樹的分析,分離株與Ch2010008、HLJ-09、CJ-13、IHNV-PRT株的核苷酸同源性分別為99.7%、99.7%、99.2%和93.7%;分離株與Ch2010008、HLJ-09、CJ-13、IHNV-PRT株的氨基酸同源性分別為100%、100%、99.0%和89.3%;系統(tǒng)進(jìn)化樹分析顯示,分離株與中國毒株Ch2010008、HLJ-09、CJ-13,韓國毒株IHNV-PRT在同一分支上,遺傳關(guān)系較近。將分離的毒株暫時(shí)命名為GS1。結(jié)果表明造成虹鱒魚死亡的病原是IHNV GS1。(2)為了進(jìn)一步了解IHNV GS1的生物學(xué)特性、來源及傳播路徑,設(shè)計(jì)了10對(duì)特異性引物對(duì)該病毒全基因進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增,設(shè)計(jì)3條特異性引物進(jìn)行該病毒3’端和5’端的快速擴(kuò)增;并對(duì)IHNV GS1的6個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白分別進(jìn)行氨基酸序列和核苷酸序列的同源性比對(duì)及系統(tǒng)進(jìn)化樹分析。結(jié)果顯示:IHNV GS1序列全長(zhǎng)為11,134bp;系統(tǒng)進(jìn)化樹分析得出,IHNV GS1的N、P和M基因與韓國毒株IHNV-PRT關(guān)系最近,G基因與韓國毒株RtGu01、RtUi02、ChYa07和日本毒株RtNag96的關(guān)系最近。結(jié)果表明,IHNV GS1屬于JRt基因型,該毒株可能源于韓國或日本,該病毒可能是由于受IHNV污染的魚卵、魚苗及幼魚的貿(mào)易所傳播。(3)由于迄今為止,還沒有任何一種疫苗被國際通用來預(yù)防IHNV,僅有加拿大本國的一種DNA疫苗獲得了疫苗生產(chǎn)許可證,且僅在加拿大使用,所以本實(shí)驗(yàn)使用甲醛和β-丙內(nèi)酯(β-propiolactone,BPL)兩種滅活劑初步研制IHNV GS1滅活苗,通過對(duì)滅活苗物理性狀的檢驗(yàn)、病毒殘余量的檢測(cè)、無菌檢驗(yàn)、安全性檢驗(yàn)、保存期試驗(yàn)和效力試驗(yàn)等實(shí)驗(yàn),得出滅活苗顏色為淡粉色或乳白色,用1 m L內(nèi)徑為1.2 mm的吸管,室溫吸取1 mL的備用疫苗,垂直放置吸管,使兩種滅活劑滅活的疫苗自然流出0.4 mL所用的時(shí)間均為0.4 s,吸取兩種滅活劑滅活的備用疫苗,呈滴狀滴入冷的蒸餾水表面,觀察到兩種疫苗均沒有擴(kuò)散,則判定為油包水劑型;兩種滅活劑滅活的抗原接種鯉魚上皮瘤細(xì)胞(EPC),盲傳2次后,在倒置顯微鏡下觀察,無細(xì)胞病變出現(xiàn);滅活的抗原注射虹鱒魚,沒有虹鱒魚死亡現(xiàn)象;滅活的抗原接種普通肉湯培養(yǎng)基、厭氧肉肝湯培養(yǎng)基、普通瓊脂培養(yǎng)基及鮮血瓊脂培養(yǎng)基,經(jīng)過培養(yǎng),均未出現(xiàn)培養(yǎng)基渾濁和培養(yǎng)板上有菌落出現(xiàn)等現(xiàn)象;兩種滅活劑滅活的疫苗,接種虹鱒魚觀察30天后,接種疫苗的虹鱒魚,無局部腫脹,無全身反應(yīng),均健康,疫苗判為合格;疫苗進(jìn)行效力實(shí)驗(yàn)得出,兩種滅活劑滅活的疫苗均有較好的防止感染IHNV的作用;初步研制的疫苗4℃保存12個(gè)月后接種虹鱒魚,免疫魚的成活率和效力試驗(yàn)的數(shù)據(jù)基本接近,所以保存期暫定為12個(gè)月。兩種滅活劑滅活的疫苗對(duì)虹鱒魚均有較好的保護(hù)性,這些研究結(jié)果為開發(fā)IHNV的滅活苗提供了研究基礎(chǔ)。
【圖文】：

3.2 病毒的毒價(jià)測(cè)定將病毒按 10-1～10-10連續(xù)做 10 倍稀釋接種于長(zhǎng)滿單層 EPC 細(xì)胞的 96 孔板中，培養(yǎng) 2 天后，根據(jù) Karber 法計(jì)算出病毒的 TCID50為 10-7.5/0.1mL（如圖 2-2）。圖 2-1 病毒分離培養(yǎng)的圖片A 為對(duì)照組圖片；B 為接毒 3 天的圖片；C 為接毒 4 天的圖片；D 為接毒 6 天的圖片F(xiàn)ig.2-1 Isolation and culture of virusA: control group; B: virus seeding for 3 day; C: virus seeding for 4 days; D: virus seedingfor 6 days.

3.3 RT-PCR 檢測(cè)結(jié)果病毒感染的細(xì)胞用 2.3.1 中所設(shè)的特異性引物進(jìn)行 RT-PCR 擴(kuò)增，，傳染性血器官壞死病病毒(IHNV)擴(kuò)增出了預(yù)期的特異性的目的條帶，而病毒性出血敗血癥病毒(VHSV)和傳染性胰臟壞死病毒(IPNV)均未能擴(kuò)增出相應(yīng)的目的條（如圖 2-3）。圖 2-2 病毒滴度結(jié)果 A 為對(duì)照組，B-I 分別為 10-1-10-8的實(shí)驗(yàn)組Fig.2-2 Result of Viral titer test A: Control Group B-I: Test Group of 10-1-10-8
【學(xué)位授予單位】：甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：S943

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本文編號(hào)：2548620