發(fā)布時間：2019-10-01 20:09

【摘要】：基因治療是指使用功能性的治療基因替換有缺陷或補充缺失的基因,或者通過抑制某些基因的表達(dá)來調(diào)控細(xì)胞的行為,從而達(dá)到治療效果。在往靶細(xì)胞傳遞基因的過程中核酸很容易被破壞或降解,因此基因治療的關(guān)鍵是需要一個有效的傳遞系統(tǒng)能夠?qū)⒑怂崴幬锇踩膫鬟f到靶細(xì)胞當(dāng)中。病毒可以有效地將自身的遺傳信息傳遞到宿主細(xì)胞中,但是病毒作為載體缺乏對細(xì)胞的特異性識別、生產(chǎn)成本高、存在免疫原性和致突變性等安全問題。而非病毒載體穩(wěn)定性好,可以長期存儲,可以運載更長的基因片段,并且非病毒基因載體的物化性質(zhì)可以通過不同的合成方法和化學(xué)修飾來調(diào)控,在構(gòu)建基因載體時更加靈活。然而,不同于病毒載體的作用機(jī)制,非病毒載體在轉(zhuǎn)染過程中需要克服細(xì)胞外和細(xì)胞內(nèi)的多層屏障,例如跨越細(xì)胞膜、內(nèi)涵體逃逸等過程,才能最終將所攜帶的核酸運載到目的地。陽離子聚合物甲基丙烯酸N,N-二甲基氨基乙酯(PDMAEMA)可以與DNA通過靜電相互作用形成納米顆粒,保護(hù)DNA免受核酸酶的降解。但較高分子量的PDMAEMA表現(xiàn)出良好轉(zhuǎn)染性能的同時也表現(xiàn)出了較高的細(xì)胞毒性。另有報道稱,相對于球形納米顆粒,具有特殊形貌的納米顆粒更易于被細(xì)胞所攝取,而細(xì)胞對納米載體的內(nèi)化效率會直接影響到最終載體的轉(zhuǎn)染性能。因此,我們結(jié)合活性可控聚合,并針對在基因治療中的關(guān)鍵問題和發(fā)展趨勢,使用小分子量的PDMAEMA修飾不同形貌納米顆粒,構(gòu)建了一系列功能化的高效基因載體。水滑石(LDH)是一種片層狀的納米顆粒,層與層之間可以通過離子交換插入陰離子藥物,從而作為藥物或基因載體。但是,目前基于LDH所設(shè)計的基因載體轉(zhuǎn)染效率都比較低。雙硫鍵具有還原響應(yīng)性,可以細(xì)胞內(nèi)還原性物質(zhì)所打斷,例如谷胱甘肽。由于腫瘤細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽含量遠(yuǎn)高于細(xì)胞外環(huán)境和正常組織細(xì)胞,故在基因載體中引入雙硫鍵可以實現(xiàn)載體在運輸過程中保持結(jié)構(gòu)穩(wěn)定,而在腫瘤組織中快速瓦解,釋放所攜帶的核酸藥物。我們首先利用LDH表面的羥基在其表面引入含有雙硫鍵的ATRP引發(fā)位點,然后使用表面引發(fā)ATRP的方法在LDH表面接枝PDMAEMA陽離子聚合物鏈,制備了一系列以片層狀結(jié)構(gòu)的LDH為基體、不同分子量PDMAEMA為聚合物側(cè)鏈,并具有還原響應(yīng)性的基因載體(LDH-PDs)。我們對LDH-PDs的形貌、攜帶DNA能力、細(xì)胞毒性、轉(zhuǎn)染效率等方面進(jìn)行了研究與討論。結(jié)果表明,與線性PDMAEMA和“國際金標(biāo)"PEI相比,這種基于片層狀LDH的基因載體顯示出了更高的細(xì)胞內(nèi)化率和轉(zhuǎn)染效率；在最佳氮磷比時,所制備的LDH-PDs基因載體在不同細(xì)胞中表現(xiàn)出的轉(zhuǎn)染效率是PEI的3-9倍。納米纖維素(CNC)屬于聚多糖納米晶,具有獨特的針狀結(jié)構(gòu)和良好的生物相容性。我們基于PDMAEMA修飾LDH制備基因載體的研究,通過對針狀CNC表面修飾,在其表面通過雙硫鍵連接PDMAEMA聚合物鏈,構(gòu)建了一系列基于CNC的基因載體(CNC-SS-PDs)。我們對CNC-SS-PDs與DNA結(jié)合的能力、還原響應(yīng)性、細(xì)胞毒性、轉(zhuǎn)染效率和體外、體內(nèi)抗腫瘤能力等進(jìn)行了測試和表征。研究表明,CNC-SS-PDs具有高效的基因轉(zhuǎn)染能力和較低的細(xì)胞毒性。同時CNC獨特的針狀形貌對細(xì)胞的內(nèi)吞有著顯著的促進(jìn)作用。通過自殺基因前藥系統(tǒng)(CD自殺基因/5-氟胞嘧啶)的體外和體內(nèi)實驗發(fā)現(xiàn),CNC-SS-PDs能有效將CD自殺基因傳遞到腫瘤細(xì)胞中。在CD自殺基因表達(dá)的胞嘧啶脫氨酶的作用下,前藥5-氟胞嘧啶轉(zhuǎn)變成為可以殺死細(xì)胞的5-氟尿嘧啶,從而誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的死亡,抑制腫瘤的生長�；趯DMAEMA修飾的CNC作為基因載體的研究,我們通過進(jìn)一步改性,在降低載體毒性同時賦予載體成像功能。我們制備了一種可以分別引發(fā)ATRP和RAFT聚合的雙功能引發(fā)劑,在CNC表面除了通過ATRP引入PDMAEMA鏈外,還使用RAFT聚合在CNC表面引入了聚(聚乙二醇乙醚)甲基丙烯酸酯(PEGEEMA)來降低載體毒性和提高載體的穩(wěn)定性。此外,成像在臨床診療過程中扮演著不可或缺的角色。許多研究都致力于將成像功能和基因治療結(jié)合在一起,實現(xiàn)在基因治療的同時對治療過程的實時監(jiān)測。金納米顆粒(AuNPs)生物相容性好,比碘基的CT造影劑有更好的造影效果。我們利用PDMAEMA側(cè)鏈上豐富的氨基作為固定位點將Au NPs固定在基于CNC的基因載體表面。通過測試發(fā)現(xiàn),表面修飾PEGEEMA和PDMAEMA側(cè)鏈的CNC載體(CNC-g-PPEG/PDMA)具有優(yōu)異的轉(zhuǎn)染性能,在最佳氮磷比時,轉(zhuǎn)染效率可達(dá)PEI的10倍。載體表面引入AuNPs后(CNC-g-PPEG/PDMA@Au),載體被賦予CT造影功能的同時,依然表現(xiàn)出與PEI相媲美的轉(zhuǎn)染效率。綜上所述,我們使用PDMAEMA修飾了不同形貌的納米顆粒構(gòu)建了一系列高性能基因載體。所做的研究對于基因治療過程中研發(fā)安全高效的非病毒載體具有一定的指導(dǎo)意義。
【圖文】：

圖１－５ＨＡ－ＲＧＤ／ＰＥＩ－ＰＢＬＧ／ＤＮＡ復(fù)合體的轉(zhuǎn)染過擅逡逑Ｆ哈邋１－５邋Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ邋ｐｒｏｃｅ巧邋ｏｆ邋ＨＡ－ＲＧＤ／ＰＥＩ－ＰＢＬＧ／ＤＮＡ訓(xùn)？逡逑７逡逑

圖１－８邋（ａ）可降解星型ＰＤＭＡＥＭＡ載體的制備過程；（ｂ）在不同ｐＨ時，星型和線型ＰＤＭＡＥＭＡ逡逑載體分別與ＤＮＡ形成不同形貌復(fù)合體逡逑Ｆｉｇ．邋１－８邋（ａ）邋Ｓｙｎ出ｅｓｉｓ邋ｏｆ邋ｓｔａｒ邋ＰＤＭＡＥＭＡ邋ｖｉａ邋ＡＴＲＰ邋ｕｓｉｎｇ邋化ｅ邋ａｒｍ－ｆｉｒｓｔ邋ｍｅｔｈｏｄ．邋Ａｌｓｏ邋ｓｈｏｗ?
【學(xué)位授予單位】：北京化工大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R450;TB383.1

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本文編號：2544561