發(fā)布時間：2019-10-01 20:09

【摘要】：基因治療是指使用功能性的治療基因替換有缺陷或補充缺失的基因,或者通過抑制某些基因的表達來調(diào)控細胞的行為,從而達到治療效果。在往靶細胞傳遞基因的過程中核酸很容易被破壞或降解,因此基因治療的關鍵是需要一個有效的傳遞系統(tǒng)能夠將核酸藥物安全的傳遞到靶細胞當中。病毒可以有效地將自身的遺傳信息傳遞到宿主細胞中,但是病毒作為載體缺乏對細胞的特異性識別、生產(chǎn)成本高、存在免疫原性和致突變性等安全問題。而非病毒載體穩(wěn)定性好,可以長期存儲,可以運載更長的基因片段,并且非病毒基因載體的物化性質可以通過不同的合成方法和化學修飾來調(diào)控,在構建基因載體時更加靈活。然而,不同于病毒載體的作用機制,非病毒載體在轉染過程中需要克服細胞外和細胞內(nèi)的多層屏障,例如跨越細胞膜、內(nèi)涵體逃逸等過程,才能最終將所攜帶的核酸運載到目的地。陽離子聚合物甲基丙烯酸N,N-二甲基氨基乙酯(PDMAEMA)可以與DNA通過靜電相互作用形成納米顆粒,保護DNA免受核酸酶的降解。但較高分子量的PDMAEMA表現(xiàn)出良好轉染性能的同時也表現(xiàn)出了較高的細胞毒性。另有報道稱,相對于球形納米顆粒,具有特殊形貌的納米顆粒更易于被細胞所攝取,而細胞對納米載體的內(nèi)化效率會直接影響到最終載體的轉染性能。因此,我們結合活性可控聚合,并針對在基因治療中的關鍵問題和發(fā)展趨勢,使用小分子量的PDMAEMA修飾不同形貌納米顆粒,構建了一系列功能化的高效基因載體。水滑石(LDH)是一種片層狀的納米顆粒,層與層之間可以通過離子交換插入陰離子藥物,從而作為藥物或基因載體。但是,目前基于LDH所設計的基因載體轉染效率都比較低。雙硫鍵具有還原響應性,可以細胞內(nèi)還原性物質所打斷,例如谷胱甘肽。由于腫瘤細胞內(nèi)谷胱甘肽含量遠高于細胞外環(huán)境和正常組織細胞,故在基因載體中引入雙硫鍵可以實現(xiàn)載體在運輸過程中保持結構穩(wěn)定,而在腫瘤組織中快速瓦解,釋放所攜帶的核酸藥物。我們首先利用LDH表面的羥基在其表面引入含有雙硫鍵的ATRP引發(fā)位點,然后使用表面引發(fā)ATRP的方法在LDH表面接枝PDMAEMA陽離子聚合物鏈,制備了一系列以片層狀結構的LDH為基體、不同分子量PDMAEMA為聚合物側鏈,并具有還原響應性的基因載體(LDH-PDs)。我們對LDH-PDs的形貌、攜帶DNA能力、細胞毒性、轉染效率等方面進行了研究與討論。結果表明,與線性PDMAEMA和“國際金標"PEI相比,這種基于片層狀LDH的基因載體顯示出了更高的細胞內(nèi)化率和轉染效率；在最佳氮磷比時,所制備的LDH-PDs基因載體在不同細胞中表現(xiàn)出的轉染效率是PEI的3-9倍。納米纖維素(CNC)屬于聚多糖納米晶,具有獨特的針狀結構和良好的生物相容性。我們基于PDMAEMA修飾LDH制備基因載體的研究,通過對針狀CNC表面修飾,在其表面通過雙硫鍵連接PDMAEMA聚合物鏈,構建了一系列基于CNC的基因載體(CNC-SS-PDs)。我們對CNC-SS-PDs與DNA結合的能力、還原響應性、細胞毒性、轉染效率和體外、體內(nèi)抗腫瘤能力等進行了測試和表征。研究表明,CNC-SS-PDs具有高效的基因轉染能力和較低的細胞毒性。同時CNC獨特的針狀形貌對細胞的內(nèi)吞有著顯著的促進作用。通過自殺基因前藥系統(tǒng)(CD自殺基因/5-氟胞嘧啶)的體外和體內(nèi)實驗發(fā)現(xiàn),CNC-SS-PDs能有效將CD自殺基因傳遞到腫瘤細胞中。在CD自殺基因表達的胞嘧啶脫氨酶的作用下,前藥5-氟胞嘧啶轉變成為可以殺死細胞的5-氟尿嘧啶,從而誘導腫瘤細胞的死亡,抑制腫瘤的生長�；趯DMAEMA修飾的CNC作為基因載體的研究,我們通過進一步改性,在降低載體毒性同時賦予載體成像功能。我們制備了一種可以分別引發(fā)ATRP和RAFT聚合的雙功能引發(fā)劑,在CNC表面除了通過ATRP引入PDMAEMA鏈外,還使用RAFT聚合在CNC表面引入了聚(聚乙二醇乙醚)甲基丙烯酸酯(PEGEEMA)來降低載體毒性和提高載體的穩(wěn)定性。此外,成像在臨床診療過程中扮演著不可或缺的角色。許多研究都致力于將成像功能和基因治療結合在一起,實現(xiàn)在基因治療的同時對治療過程的實時監(jiān)測。金納米顆粒(AuNPs)生物相容性好,比碘基的CT造影劑有更好的造影效果。我們利用PDMAEMA側鏈上豐富的氨基作為固定位點將Au NPs固定在基于CNC的基因載體表面。通過測試發(fā)現(xiàn),表面修飾PEGEEMA和PDMAEMA側鏈的CNC載體(CNC-g-PPEG/PDMA)具有優(yōu)異的轉染性能,在最佳氮磷比時,轉染效率可達PEI的10倍。載體表面引入AuNPs后(CNC-g-PPEG/PDMA@Au),載體被賦予CT造影功能的同時,依然表現(xiàn)出與PEI相媲美的轉染效率。綜上所述,我們使用PDMAEMA修飾了不同形貌的納米顆粒構建了一系列高性能基因載體。所做的研究對于基因治療過程中研發(fā)安全高效的非病毒載體具有一定的指導意義。
【圖文】：

圖１－５ＨＡ－ＲＧＤ／ＰＥＩ－ＰＢＬＧ／ＤＮＡ復合體的轉染過擅逡逑Ｆ哈邋１－５邋Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ邋ｐｒｏｃｅ巧邋ｏｆ邋ＨＡ－ＲＧＤ／ＰＥＩ－ＰＢＬＧ／ＤＮＡ訓？逡逑７逡逑

圖１－８邋（ａ）可降解星型ＰＤＭＡＥＭＡ載體的制備過程；（ｂ）在不同ｐＨ時，星型和線型ＰＤＭＡＥＭＡ逡逑載體分別與ＤＮＡ形成不同形貌復合體逡逑Ｆｉｇ．邋１－８邋（ａ）邋Ｓｙｎ出ｅｓｉｓ邋ｏｆ邋ｓｔａｒ邋ＰＤＭＡＥＭＡ邋ｖｉａ邋ＡＴＲＰ邋ｕｓｉｎｇ邋化ｅ邋ａｒｍ－ｆｉｒｓｔ邋ｍｅｔｈｏｄ．邋Ａｌｓｏ邋ｓｈｏｗ?
【學位授予單位】：北京化工大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R450;TB383.1

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