【摘要】：小麥是世界上重要的糧食作物之一,它的生產(chǎn)直接影響著全球的糧食安全。小麥能夠提供人類20%的熱量和蛋白質(zhì),同時也是我國的第二大糧食作物。油菜素類固醇(Brassinosteroids,BR)是重要的植物生長激素,在植物生長發(fā)育的各個階段發(fā)揮著重要的作用。目前對BR合成的調(diào)控機理及其對植物生長發(fā)育影響的研究主要在水稻、擬南芥中,而在重要的糧食作物小麥中鮮有報道。DWF4在BR合成路徑中是一個關(guān)鍵的限速酶基因。為了解DWF4基因在小麥生長發(fā)育過程中的作用,本研究以同源搜索的方式從小麥中克隆得到的與擬南芥BR合成路徑中的關(guān)鍵合成基因AtDWF4同源的基因為對象,命名為TaDWF4,同時存在反饋抑制現(xiàn)象,構(gòu)建由35S驅(qū)動的TaDWF4超表達載體35S::TaDWF4,農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化擬南芥,獲得多個TaDWF4轉(zhuǎn)基因擬南芥植株,觀察擬南芥表型的差異。得到以下主要結(jié)論:1.以擬南芥AtDWF4在小麥基因數(shù)據(jù)庫中進行同源搜索,通過進化樹分析、結(jié)構(gòu)域分析、轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析和序列完整度分析,最終確定小麥BR合成基因TaDWF4是Traes_4AS_C318715F9.1和Traes_4BL_BAFA18B1D.1。2.通過實時定量PCR檢測,當外施高濃度BR后,小麥TaDWF4基因的表達量就會顯著降低,說明小麥TaDWF4存在BR反饋抑制現(xiàn)象。3.采用Gateway體外重組技術(shù)進行小麥TaDWF4基因的克隆,克隆結(jié)果顯示,Traes_4BL_BAFA18B1D.1測序結(jié)果與小麥數(shù)據(jù)庫提供序列一致,而Traes_4AS_C318715F9.1在426位測序少了一個氨基酸谷氨酰胺Gln,因此我們認為小麥數(shù)據(jù)庫提供的Traes_4AS_C318715F9.1基因序列是有誤的,正確的氨基酸序列應(yīng)該是缺少谷氨酰胺的。4.將構(gòu)建好的TaDWF4基因超表達載體35S::TaDWF4轉(zhuǎn)農(nóng)桿菌感受態(tài)GV3101中,農(nóng)桿菌侵染擬南芥Col、Ws2、雜合dwf4-44和bri1-5。經(jīng)除草劑篩選和目的基因PCR鑒定,共得到轉(zhuǎn)基因植株337株。5.觀察轉(zhuǎn)基因陽性植株的表型發(fā)現(xiàn),小麥TaDWF4基因轉(zhuǎn)野生型Col、Ws2和dwf4-44突變體后,與轉(zhuǎn)基因背景相比,植株都表現(xiàn)為葉柄明顯變長,同時葉形也發(fā)生了變化,蓮座葉的長度和寬度均減少,長寬比變大,葉面積變小,且蓮座葉兩側(cè)向內(nèi)卷曲。小麥TaDWF4基因在bri1-5中超表達后使bri1-5突變體表型得以部分恢復(fù),超表達植株葉柄明顯變長,同時蓮座葉葉形也發(fā)生變化,蓮座葉卷曲程度下降,且長寬比變大,這與超表達擬南芥AtDWF4基因在bri1-5突變體的表型是一致的。6.綜上可知,在本研究中所篩選到的兩個基因與擬南芥中的At DWF4基因功能相似,確定其為小麥中BR合成過程中的關(guān)鍵限速酶基因。研究結(jié)果表明,在小麥中至少存在兩個具有DWF4功能的基因。
【圖文】：

能夠有效地調(diào)控植物體內(nèi) BR 的生物合成水平。AtDWF4 蛋白包含 5氨基酸，其中 400 多個氨基酸為細胞色素 P450 氧化酶的結(jié)構(gòu)域（圖 3-1），將 AtDW基酸序列遞交至在線結(jié)構(gòu)域預(yù)測工具 SMART（http://smart.embl-heidelberg.de/）即到結(jié)構(gòu)域。其氨基酸下列如下：AT3G50660.1FETEHHTLLPLLLLPSLLSLLLFLILLKRRNRKTRFNLPPGKSGWPFLGETIGYLKPYTTLGDFMQQHVSKYGKIYRSNLFGEPTIVSADAGLNRFILQNEGRLFECSYPRSIGGGKWSMLVLVGDMHRDMRSISLNFLSHARLRTILLKDVERHTLFVLDSWQQNSIFSDEAKKFTFNLMAKHIMSMDPGEEETEQLKKEYVTFMKGVVSAPLNLPGTAYHKASRATILKFIERKMEERKLDIKEEDQEEEEVKTEDEAEMSKSDHVRKQRTDDDLLGWLKHSNLSTEQILDLILSLLFAGHETSSVAIALAIFFLQACPKAVEELREEHLEIARAKKGESELNWDDYKKMDFTQCVINETLRLGNVVRFLHRKALKDVRYKGYDIPSGWKVVISAVHLDNSRYDQPNLFNPWRWQQQNNGASSSGSGSFSTWGNNYMPFGGGPRLGSELAKLEMAVFIHHLVLKFNWELAEDDKPFAFPFVDFPNGLPIRVSRIL*

0小麥 BR 合成基因 TaDWF4 的鑒定與功能研究表明，如果某個基因在植物生長發(fā)育過程中發(fā)揮重平相對來說是較高的。所以進一步根據(jù)基因表達水平來篩因。對照本實驗室已有的小麥轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，分析這 9 個候（圖 3-3），，發(fā)現(xiàn)位于 4 號染色體上的候選基因轉(zhuǎn)錄水平表色體上的候選基因表達量都較少，有的候選基因甚至沒有確定小麥TaDWF4基因位于4號染色體上。同時對候選基因-4），Traes_4BL_BAFA18B1D.1 基因和 Traes_4AS_C318715raes_4DL_3A16689F6.1 基因序列不完整，無法進行后續(xù)試色體上的基因 Traes_4BL_BAFA18B1D.1 和 Traes_4AS_C因。
【學位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：S512.1

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 Yahu Gao;Dongzhi Zhang;Jia Li;;TCP1 Modulates DWF4 Expression via Directly Interacting with the GGNCCC Motifs in the Promoter Region of DWF4 in Arabidopsis thaliana[J];Journal of Genetics and Genomics;2015年07期

本文編號：2544176