【摘要】：昆蟲是地球上種類最多的動(dòng)物群體。與脊椎動(dòng)物不同,昆蟲沒有獲得性免疫,只能依靠自身的天然免疫抵御外界微生物的入侵。天然免疫是機(jī)體的第一道防線。微生物入侵時(shí),一組種系編碼的模式識(shí)別受體可以識(shí)別并結(jié)合到保守的病原體相關(guān)分子模式上,通過一系列的信號(hào)傳導(dǎo)產(chǎn)生抗菌肽最終消滅微生物。Toll信號(hào)通路是目前研究最多的一條信號(hào)通路,昆蟲Spatzle(spz)在Toll信號(hào)通路中發(fā)揮重要作用。本實(shí)驗(yàn)通過克隆家蠶Spatzle5(Bmspz5)基因、生物信息學(xué)分析、組織特異性表達(dá)、微生物誘導(dǎo)表達(dá)、RNA干擾等一系列實(shí)驗(yàn)來研究Bmspz5基因的特性和參與的Toll信號(hào)通路。具體的實(shí)驗(yàn)內(nèi)容如下:本實(shí)驗(yàn)成功克隆出Bmspz5的ORF和3’非編碼區(qū),該基因位于7號(hào)染色體上,在基因組中只有1個(gè)拷貝,共有6個(gè)外顯子,5個(gè)內(nèi)含子,外顯子/內(nèi)含子邊界處均符合GT-AG規(guī)則。該基因共編碼405個(gè)氨基酸,通過序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)其C末端比家蠶基因組數(shù)據(jù)庫預(yù)測的ORF多出56個(gè)氨基酸。蛋白質(zhì)分子質(zhì)量為45.93 kD,等電點(diǎn)為8.96,為胞外蛋白,疏水區(qū)和親水區(qū)域交錯(cuò)排列。生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)Bmspz5與果蠅和煙草天蛾的親緣關(guān)系較近,并含有相同的七個(gè)保守的半胱氨酸結(jié)構(gòu)域。半定量RT-PCR分析Bmspz5的組織表達(dá)情況,結(jié)果表明,Bmspz5基因在家蠶五齡三天幼蟲各組織中的表達(dá)量都不相同,其中在頭部中的表達(dá)量最高,在皮膚中的表達(dá)量相對(duì)較高,而在其他組織當(dāng)中幾乎都沒有表達(dá)。微生物誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,注射酵母菌和枯草芽孢桿菌能夠引起B(yǎng)mspz5基因在表皮中的表達(dá)量上調(diào),而注射大腸桿菌則不能影響B(tài)mspz5基因在表皮中的表達(dá)量,而在頭中,注射酵母菌、枯草芽孢桿菌和大腸桿菌均不能引起B(yǎng)mspz5基因的表達(dá)量上調(diào)。因此,我們可以推斷Bmspz5基因參與了體壁中家蠶抵御真菌和革蘭氏陽性菌入侵的免疫應(yīng)答反應(yīng)。RNA干擾實(shí)驗(yàn)表明,體壁中酵母菌感染后,Bmspz5基因的沉默能夠明顯抑制轉(zhuǎn)錄因子Cactus、Rel和抗菌肽Attain、Moricn和Gloverin的表達(dá);注射芽孢桿菌時(shí),也有類似的結(jié)果,但是抑制效率沒有酵母菌的高。由此可見,Bmspz5基因沉默可以抑制抗菌肽Attain、Gloverin、Moricn和Toll通路中的轉(zhuǎn)錄因子Cactus、Rel的表達(dá),而不能抑制IMD通路中轉(zhuǎn)錄因子Relish的表達(dá)。結(jié)果表明,Bmspz5基因參與家蠶體壁中Toll信號(hào)通路的免疫應(yīng)答。
【圖文】：

4圖 1.1 果蠅 spz 的激活機(jī)制[27]Fig. 1.1 The activation mechanism of Drosophila spz[27]1.2.1.2 煙草天蛾的 spz 的研究進(jìn)展煙草天蛾的 spz1 由于選擇性剪接形成兩個(gè)不同 cDNA，prospz1B 的前結(jié)構(gòu)域插入10 個(gè)氨基酸殘基，而 prospz1A 中則不存在。prospz1A cDNA 編碼一個(gè) 32.7 kDa 的多肽，，與果蠅和家蠶 spz1 分別有 23％和 44％的同一性的。重組 prospz1A 是一個(gè)二硫鍵連接的同型二聚體[28]。煙草天蛾 prospz1A 的裂解激活需要絲氨酸蛋白酶的作用，已經(jīng)在煙草天蛾的血淋巴中確定了超過 20 個(gè)的絲氨酸蛋白酶，但只有少數(shù)的功能已經(jīng)知道。煙草天蛾血淋巴蛋白酶 6 和 8（HP6 和 HP8）各由一個(gè)氨基末端結(jié)構(gòu)域和羧基末端蛋白酶域組成。HP6

由 Rel1 介導(dǎo)的。spz1C 在脂肪體中組成型表達(dá)，而 spz1B 主要在雌蚊卵巢組織中。RNA 干擾敲除 spz1C 導(dǎo)致埃及伊文 Toll/ Rel1（NF-κB 轉(zhuǎn)錄因子果蠅 Dorsal 的物）通路的缺陷，表明埃及伊蚊 spz1C 的功能在脂肪體中介導(dǎo)真菌感染的免疫應(yīng)]。在岡比亞按蚊中，六種果蠅 spz（spz1-6）的同源物在基因組中被鑒定[35]。目前已在多種生物中鑒定出 spz 基因，對(duì)不同物種的 spz 基因編碼的蛋白序列進(jìn)緣分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)家蠶、意蜂、印度跳蟻、麗蠅蛹集金小蜂、豌豆蚜、埃及伊蚊蠅、岡比亞按蚊、赤擬谷盜等昆蟲的 spz 親緣關(guān)系較近， 而與哺乳動(dòng)物的 spz 親系相對(duì)較遠(yuǎn)(圖 1.2)。對(duì)不同的昆蟲的 spz 同源蛋白的氨基酸保守序列進(jìn)行比對(duì)，赤擬 谷盜、岡比亞安蚊、果蠅、煙草天蛾、埃及伊蚊、家蠶及豌豆長管蚜 spz 的酸序列有 7 個(gè)相同的半胱氨酸同源結(jié)構(gòu)域。表明昆蟲 spz 在進(jìn)化上比較保守，可有相似的生物學(xué)功能，因此，為我們研究家蠶新的 spz 基因提供理論依據(jù)和研究。
【學(xué)位授予單位】：江蘇科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S884

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