【摘要】：【目的】通過(guò)外源表達(dá)手段構(gòu)建重組畢赤酵母實(shí)現(xiàn)木糖苷酶的高效表達(dá)。【方法】基于畢赤酵母密碼子偏好性?xún)?yōu)化嗜熱棉毛菌β-木糖苷酶(Xyl43)基因密碼子,將其導(dǎo)入畢赤酵母GS115中實(shí)現(xiàn)分泌表達(dá),并對(duì)重組木糖苷酶酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行分析。通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)優(yōu)化高產(chǎn)菌株的搖瓶發(fā)酵條件,并在5 L發(fā)酵罐中進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)�！窘Y(jié)果】Xyl43基因優(yōu)化后的序列中222個(gè)堿基發(fā)生改變,G+C含量由52.8%降低到44.6%,序列一致性為78.17%;將構(gòu)建的表達(dá)載體p PIC9K-Opt Xyl43電擊轉(zhuǎn)入畢赤酵母中,利用平板初篩和搖瓶復(fù)篩獲得一株高效表達(dá)重組菌(命名為P.pastoris GS115-Xyl43);其所產(chǎn)重組木糖苷酶大小為51.5 k D,動(dòng)力學(xué)參數(shù)Km為2.93 mmol/L、Vmax為157.9μmol/(min·mg),最適反應(yīng)溫度55°C,最適p H 7.0,在p H 6.0-9.5條件下具有良好的穩(wěn)定性;搖瓶?jī)?yōu)化結(jié)果表明:培養(yǎng)基初始p H 6.0、甲醇補(bǔ)加濃度1.0%、培養(yǎng)溫度28°C、搖床轉(zhuǎn)速250 r/min為最佳產(chǎn)酶條件,在此條件下發(fā)酵144 h胞外酶活達(dá)到42 U/m L(蛋白含量0.54 g/L);5 L發(fā)酵罐放大培養(yǎng),發(fā)酵156 h(甲醇誘導(dǎo)96 h),木糖苷酶酶活為222.2 U/m L,蛋白含量2.36 g/L,較搖瓶提高了4.3倍�！窘Y(jié)論】木糖苷酶在畢赤酵母中實(shí)現(xiàn)了高效表達(dá),具有較好的工業(yè)化應(yīng)用前景。
【作者單位】： 江南大學(xué)生物工程學(xué)院工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室;南京林業(yè)大學(xué)江蘇省生物質(zhì)綠色燃料與化學(xué)品重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室;河南天冠企業(yè)集團(tuán)有限公司車(chē)用生物燃料技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室;南陽(yáng)理工學(xué)院生物與化學(xué)工程學(xué)院;
【基金】：國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(No.21176106) 車(chē)用生物燃料技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開(kāi)放基金項(xiàng)目(No.KFKT2013010) 中國(guó)博士后科學(xué)基金項(xiàng)目(No.2015M571666) 江蘇省生物質(zhì)綠色燃料與化學(xué)品重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室資助項(xiàng)目(No.JSBGFC14006) 河南省科技開(kāi)放合作項(xiàng)目(No.162106000007)~~
【分類(lèi)號(hào)】：Q78;Q55

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本文編號(hào)：2541254