【摘要】：骨質(zhì)疏松(Osteoporosis, OP)的主要表現(xiàn)為骨密度(bone mineral density, BMD)降低,骨皮質(zhì)較正王常變薄,骨小梁數(shù)目少于平常水平,骨髓腔擴(kuò)大,容易導(dǎo)致骨質(zhì)疏松性骨折。骨質(zhì)疏松性骨折臨床上以脊柱椎體壓縮性骨折,橈骨遠(yuǎn)端骨折等多見(jiàn),引起駝背,身體縮短以及呼吸系統(tǒng)的疾病,常常需要較長(zhǎng)時(shí)間臥床修養(yǎng),嚴(yán)重影響病人的生活質(zhì)量,甚至并發(fā)褥瘡,肺內(nèi)感染,泌尿系感染等疾病,威脅患者的生命,故亟需進(jìn)一步研究骨質(zhì)疏松的發(fā)病機(jī)制以及骨質(zhì)疏松性骨折的愈合機(jī)制。針對(duì)以上問(wèn)題,本文將研究了骨保護(hù)素(osteoprotegerin, OPG)遺傳多態(tài)性與骨礦物質(zhì)密度(bone mineral density, BMD)和骨質(zhì)疏松的相關(guān)性,OPG基因突變對(duì)蛋白表達(dá)和生物活性的影響及其影響破骨細(xì)胞分化成熟的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制,以期進(jìn)一步了解骨質(zhì)疏松的發(fā)病機(jī)制,研究了骨質(zhì)疏松性骨折與血清神經(jīng)生長(zhǎng)因子相關(guān)性,并探討了神經(jīng)生長(zhǎng)因子促進(jìn)骨質(zhì)疏松性骨折愈合的可能機(jī)制,為骨質(zhì)疏松及其骨質(zhì)疏松性骨折的治療提供支持。具體的研究包括以下幾個(gè)方面：(1)研究了骨保護(hù)素基因g.27563GA遺傳多態(tài)性與絕經(jīng)女性骨密度關(guān)系的問(wèn)題。骨質(zhì)疏松的主要表現(xiàn)為骨密度降低,骨小梁的數(shù)目減少,骨皮質(zhì)變薄,髓腔增寬,容易導(dǎo)致骨質(zhì)疏松性骨折。研究納入435名絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松女性和442名年齡相仿的健康女性為對(duì)照進(jìn)行病例對(duì)照研究。用美國(guó)NORLAND公司XR-46型雙能X線骨密度儀評(píng)估髖股骨頸、腰椎(L24)和全髖關(guān)節(jié)骨礦物質(zhì)密度。應(yīng)用創(chuàng)造酶切位點(diǎn)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(CRS-PCR)和DNA測(cè)序方法檢測(cè)g.27563GA骨保護(hù)素遺傳多態(tài)性基因型。我們發(fā)現(xiàn)g.27563GA骨保護(hù)素遺傳多態(tài)性為錯(cuò)義突變,導(dǎo)致了精氨酸(Arg)至谷氨酰胺(Gln)的氨基酸(p.Arg333Gln)置換。骨保護(hù)素g.27563GA遺傳多態(tài)性基因型髖股骨頸、腰椎(L2-4)和全髖關(guān)節(jié)骨礦物質(zhì)密度明顯不同。GG基因型的骨礦物質(zhì)密度值明顯高于其他基因型GA和從(P0.05),故認(rèn)為骨保護(hù)素g.27563GA基因遺傳多態(tài)性A等位基因可能與絕經(jīng)后女性骨礦物質(zhì)密度值低相關(guān),從而增加骨質(zhì)疏松發(fā)生的危險(xiǎn)。(2)研究了OPG基因突變對(duì)蛋白表達(dá)和生物活性的影響。我們通過(guò)CRS-PCR方法在OPG基因第5外顯子發(fā)現(xiàn)g.27563GA基因遺傳多態(tài)性,隨后分析了該遺傳多態(tài)性與BMD和骨質(zhì)疏松的潛在關(guān)系。結(jié)果顯示中國(guó)絕經(jīng)期女性骨密度和骨質(zhì)疏松與遺傳多態(tài)性有顯著相關(guān)性。然而,OPG的基因多態(tài)性與骨質(zhì)疏松之間的具體聯(lián)系并不清楚。故本部分在成功構(gòu)建體外過(guò)表達(dá)野生型和突變型OPG基因的細(xì)胞培養(yǎng)體系的基礎(chǔ)上,研究突變對(duì)OPG的.蛋白表達(dá)和活性影響。結(jié)果表明基因突變不能影響OPG的蛋白表達(dá)水平,但是能夠抑制其正�；钚�。(3)研究了OPG基因突變影響破骨細(xì)胞分化成熟的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制。我們觀察了野生型和突變型OPG基因所表達(dá)的蛋白在破骨細(xì)胞的分化與活化功能上是否存在差異。結(jié)果表明野生型OPG能夠抑制破骨細(xì)胞的分化,而突變型的OPG抑制作用顯著低于野生型。然而,具體作用機(jī)制仍不清楚,需要進(jìn)一步研究。破骨細(xì)胞從起源發(fā)育至成熟,再經(jīng)活化發(fā)揮吸收作用是一個(gè)復(fù)雜的多級(jí)調(diào)控過(guò)程,介導(dǎo)破骨細(xì)胞分化成熟的信號(hào)傳導(dǎo)路徑主要包括絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases, MAPK)、核轉(zhuǎn)錄因子kappa B (NF-κB)和鈣調(diào)磷酸酶／活化T細(xì)胞核因子(CN/NFAT)等通路。本章內(nèi)容將研究OPG基因突變能否影響破骨細(xì)胞分化過(guò)程中MAPK信號(hào)通路和Ca2+信號(hào)通路。(4)研究了骨質(zhì)疏松性骨折與血清神經(jīng)生長(zhǎng)因子相關(guān)性的問(wèn)題。骨質(zhì)疏松癥最大的危害是導(dǎo)致骨折。骨強(qiáng)度降低導(dǎo)致骨質(zhì)疏松性骨折,由于屬于脆性骨折,所以輕微的損傷如摔倒、扭傷等即可發(fā)生骨質(zhì)疏松性骨折常發(fā)生于橈骨(遠(yuǎn)端骨折)、肱骨(近端骨折)、脊椎(胸腰段)。研究納入102名絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松性骨折女性,102名絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松女性和102名年齡相仿的健康女性,進(jìn)行病例對(duì)照研究。所有入選對(duì)象均抽取空靜脈血 5m1,采用雙抗體夾心固相酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測(cè)血清神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)水平,發(fā)現(xiàn)骨質(zhì)疏松及骨質(zhì)疏松性骨折患者與年齡相仿的健康女性相比,血清NGF水平下降(P0.05),說(shuō)明NGF水平下降可能是導(dǎo)致骨質(zhì)疏松和骨質(zhì)疏松性骨折的因素。(5)研究了探討神經(jīng)生長(zhǎng)因子(nerve growth factor, NGF)對(duì)兔骨折愈合過(guò)程中骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bone morphogenetic protein, BMP)表達(dá)的影響。健康新西蘭大耳白兔108只,制備標(biāo)準(zhǔn)的兔右側(cè)橈骨骨折模型,A組采用肌肉注射N(xiāo)GF1周,200ng/Kg/次,一日二次；B組采用腹腔注射N(xiāo)GF抗體三周,400ng/次,一日三次,C組注射生理鹽水三周,1ml/次,一日二次。進(jìn)行BMP蛋白Western免疫印記分析,Gel Doc2000圖像分析,發(fā)現(xiàn)在各個(gè)時(shí)相點(diǎn),NGF組比抗NGF抗體組、對(duì)照組誘導(dǎo)骨組織內(nèi)BMP表達(dá)量多,且NGF組骨組織中BMP表達(dá)時(shí)間延長(zhǎng),高峰濃度提前、下降緩慢(P0.05)。說(shuō)明神經(jīng)生長(zhǎng)因子促進(jìn)骨折愈合的機(jī)制可能是：通過(guò)促進(jìn)骨折愈合過(guò)程中BMP的表達(dá)促進(jìn)骨折愈合。(6)研究了神經(jīng)生長(zhǎng)因子對(duì)兔骨折愈合過(guò)程中血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子表達(dá)的影響。建立標(biāo)準(zhǔn)兔橈骨骨折模型,分別用神經(jīng)生長(zhǎng)因子、神經(jīng)生長(zhǎng)因子單克隆抗體和生理鹽水進(jìn)行干預(yù),用Western blot免疫印跡分析方法檢測(cè)損傷后24,48h和損傷后1,3,6,8周,骨折端組織血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子蛋白的表達(dá),發(fā)現(xiàn)3組各時(shí)間點(diǎn)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子表達(dá)的關(guān)系為：應(yīng)用神經(jīng)生長(zhǎng)因子組對(duì)照組拮抗神經(jīng)生長(zhǎng)因子組(P0.05)。說(shuō)明在骨折愈合過(guò)程當(dāng)中,應(yīng)用神經(jīng)生長(zhǎng)因子可以促進(jìn)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子表達(dá)。通過(guò)上述研究,發(fā)現(xiàn)骨保護(hù)素g.27563GA基因遺傳多態(tài)性A等位基因可能與中國(guó)絕經(jīng)后女性骨礦物質(zhì)密度值低相關(guān),從而增加骨質(zhì)疏松發(fā)生的危險(xiǎn)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)OPG基因突變雖然不影響OPG蛋白表達(dá)水平,但能夠抑制其正�；钚�,對(duì)破骨細(xì)胞分化的影響與p38和JNK信號(hào)通路有密切聯(lián)系。神經(jīng)系統(tǒng)與骨組織密切相關(guān),可能通過(guò)神經(jīng)遞質(zhì)、外周神經(jīng)突觸以及激素共同調(diào)控骨的正王常代謝及骨折修復(fù)。在后3部分研究中,我們首次發(fā)現(xiàn)血清神經(jīng)生長(zhǎng)因子的水平與骨疏松及骨質(zhì)疏松性骨折具有明顯相關(guān)性,提示血清神經(jīng)生長(zhǎng)因子水平的下降,可能導(dǎo)致骨質(zhì)疏松及骨質(zhì)疏松性骨折,為骨質(zhì)疏松及骨質(zhì)疏松性骨折的研究開(kāi)啟了全新的視角。神經(jīng)生長(zhǎng)因子促進(jìn)骨折愈合的機(jī)制可能是在骨折愈合過(guò)程中,通過(guò)促進(jìn)BMP和VEGF的表達(dá)實(shí)現(xiàn),提示NGF可以在骨質(zhì)疏松和骨質(zhì)疏松性骨折的防治中,起到重要的作用。
【圖文】：

２．２．３邋ＯＰＧ基因多態(tài)性和ＢＭＤ關(guān)聯(lián)性分析逡逑骨質(zhì)疏松患者組和健廢對(duì)照組ｇ．２７％３Ｇ＞Ａ基因多態(tài)性特征見(jiàn)表３，包括年齡、體逡逑重、身高、體重質(zhì)數(shù)，髓股骨頸，脊柱和全髓關(guān)節(jié)骨礦物質(zhì)密度（圖２．１）。結(jié)果顯示不同逡逑基因型髓股骨頸，巧柱和全髓關(guān)巧骨礦物質(zhì)密度有思著性差異，，ＧＧ基因型骨密度值較逡逑ＧＡ和ＡＡ基因型高（Ｐ＜０．０＾邋（表２．３）。逡逑Ｓａｍｐｌｅ邋ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ邋ｆｎ邋ｔｈｅ邋３邋ｇｒｏｕｐｓ逡逑§邋１邐逡逑巧ＧＧ逡逑ａ邋ＧＡ逡逑曼邐耐邐邐ｙ．逡逑ｔ．邐？逡逑TB邐邐邐逡逑１逡逑｜Ｉ｜邋工巧■邋ｒＭｌ＊逡逑ｓ邐畫(huà)邐醒逡逑Ａｇｅ邐Ｈｅｉｇｈｔ邐Ｗｅｉｇｈｔ邐己邋Ｍｌ邐？逡逑■逡逑圖２．邋１不同基因型女性患者組基本資料比較逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋２．１邐Ｃｈａｒａｃ化ｒｉｓｔｉｃｓ邋ｉｎ邋ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ邋ｇｅｎｏｔｙｐｅｓ邋ｇｒｏｕｐｓ逡逑１９逡逑

平的可能性進(jìn)行探討，建立了巧變型ＯＰＧ表達(dá)質(zhì)粒，然后穩(wěn)定轉(zhuǎn)染至ＨＥＫ２９３細(xì)胞。逡逑野生型和突變型的ＯＰＧｍＲＮＡ和蛋白表達(dá)水平分別使用Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ半定量ＰＣ民和逡逑Ｗｅｓｔｅｒｎ邋Ｂｌｏｔｔｉｎｇ進(jìn)行檢測(cè)。如圖３．１所示，ＯＰＧ表達(dá)質(zhì)粒的細(xì)胞被轉(zhuǎn)染后，ＯＰＧｍＲＮＡ逡逑和蛋白表達(dá)水平均上升，然而，ＨＥＫ２９３細(xì)胞系中的基因突變不影響ＯＰＧｍＲＮＡ和蛋白逡逑表達(dá)水平。因此，本研究認(rèn)為基因巧變對(duì)ＯＰＧ的表達(dá)水平無(wú)調(diào)節(jié)作用。逡逑２７逡逑
【學(xué)位授予單位】：大連理工大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：R580;R683

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本文編號(hào)：2540228