【摘要】：萊氏野村菌(Nomuraea rileyi)是一種昆蟲(chóng)病原真菌,自然條件下可以侵染斜紋夜蛾等多種鱗翅目害蟲(chóng),因此可以作為環(huán)境友好型的生物農(nóng)藥應(yīng)用于害蟲(chóng)防治。真菌生物農(nóng)藥通常情況下以分生孢子作為有效活性成分,鑒于萊氏野村菌產(chǎn)孢條件苛刻,且在田間應(yīng)用中易受溫度、濕度、光照等多種環(huán)境因素制約,本實(shí)驗(yàn)室通過(guò)液體發(fā)酵誘導(dǎo)培養(yǎng)出微菌核,具有抗逆性強(qiáng)、貨架期長(zhǎng)、穩(wěn)定性高、持續(xù)侵染等優(yōu)點(diǎn),可以取代分生孢子發(fā)揮侵染作用。因此,對(duì)萊氏野村菌抗逆功能的研究以及對(duì)微菌核形成的分子機(jī)理研究有助于改善其在生物防治中的應(yīng)用前景。Rho GTPase是Ras超家族小G蛋白的最主要成員,作為分子開(kāi)關(guān)控制細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑,在參與調(diào)控細(xì)胞極性生長(zhǎng)和正常的形態(tài)建成中發(fā)揮重要作用。一方面,前人發(fā)現(xiàn)萊氏野村菌微菌核的形成與極性生長(zhǎng)密切相關(guān);另一方面,截止目前,在昆蟲(chóng)病原真菌中有關(guān)Rho基因家族的生物學(xué)功能研究尚未有過(guò)報(bào)道。鑒于此,本文以萊氏野村菌為研究對(duì)象,根據(jù)轉(zhuǎn)錄組信息,克隆目前僅發(fā)現(xiàn)的Rho1、Rho2、Rho3三個(gè)基因。通過(guò)國(guó)內(nèi)外率先構(gòu)建的根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化體系,采用基因敲除的方式,對(duì)Rho基因家族進(jìn)行功能研究,主要研究結(jié)果如下:(1)萊氏野村菌Rho家族基因的克隆與序列分析根據(jù)萊氏野村菌轉(zhuǎn)錄組文庫(kù)Unigene序列,首次從萊氏野村菌CQNr01菌株中克隆得到3個(gè)Rho-GTPase家族基因,依次命名為Nr Rho1,Nr Rho2、Nr Rho3,登錄號(hào)分別為KU948934、KU948935、KU948936。序列比對(duì)分析顯示:Nr Rho1開(kāi)放閱讀框?yàn)?07bp,編碼268個(gè)氨基酸,含有2個(gè)內(nèi)含子;Nr Rho2開(kāi)放閱讀框?yàn)?03bp,編碼200個(gè)氨基酸,含有3個(gè)內(nèi)含子;Nr Rho3開(kāi)放閱讀框?yàn)?51bp,編碼216個(gè)氨基酸,含有4個(gè)內(nèi)含子。生物信息學(xué)分析表明Nr Rho X(X=1,2,3,下同)蛋白分子量依次為29.9k Da、22.0k Da、23.7k Da;理論等電點(diǎn)分別為8.32、5.35、4.74;蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)均主要以無(wú)規(guī)則卷曲為主要構(gòu)象,均不具有跨膜結(jié)構(gòu)域和信號(hào)肽;隸屬于Ras超家族,存在Rho家族共同的保守結(jié)構(gòu)域:GTP Mg2+結(jié)合位點(diǎn)、G1-G5 box、switch I和switch II區(qū)域。同源比對(duì)和系統(tǒng)進(jìn)化分析表明,Rho X基因所編碼的蛋白與13種真菌的Rho蛋白序列同源性在41.18%-96.13%之間,分別聚類到Rho GTPase家族3個(gè)獨(dú)立的分支上,與昆蟲(chóng)病原真菌—羅伯茨綠僵菌的親緣關(guān)系最近。(2)Rho家族基因敲除載體構(gòu)建和缺失突變株篩選采用基于FPNI-PCR的染色體步移技術(shù),成功克隆Rho X基因上下游1500-2000bp左右的未知序列。分別構(gòu)建3個(gè)Rho單基因敲除載體Pzp-hph-Rho X,利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化體系在萊氏野村菌中分別實(shí)現(xiàn)Rho1、Rho2、Rho3單基因敲除,篩選得到3個(gè)基因的缺失突變株△rho1、△rho2、△rho3。(3)Rho缺失突變菌株表型分析缺失突變體表型分析結(jié)果表明:rho基因缺失對(duì)孢子形態(tài)無(wú)影響而會(huì)導(dǎo)致菌絲分支增多等異常形態(tài)。基礎(chǔ)培養(yǎng)基中,缺失突變菌株前期生長(zhǎng)緩慢,△rho1菌落邊緣光滑,孢子呈酵母態(tài),向菌絲態(tài)轉(zhuǎn)換時(shí)間明顯延遲�！鱮ho2、△rho3產(chǎn)孢量相比于野生型顯著降低48.93%、86.49%�？鼓嫘苑治鲲@示,Δrho1、Δrho2、Δrho3對(duì)剛果紅和熒光增白劑的敏感性升高,兩型轉(zhuǎn)換時(shí)間推遲,菌落生長(zhǎng)受到明顯的抑制。除對(duì)SDS不敏感之外,在鹽脅迫、滲透壓脅迫、氧脅迫條件下,缺失突變菌株各自顯示出不同程度的生長(zhǎng)缺陷,產(chǎn)孢能力也表現(xiàn)出不同程度的下降。Rho基因缺失均未顯著影響分生孢子對(duì)濕熱脅迫的耐受力,紫外輻射處理分生孢子后△rho1萌發(fā)率降低,說(shuō)明rho1缺失使得孢子對(duì)UV-B敏感性提高,rho2、rho3基因缺失使得分生孢子對(duì)UV-B輻射的耐受力無(wú)明顯改善�！鱮ho1、△rho3形成微菌核的時(shí)間延遲,微菌核部分顆粒變大且形態(tài)大小不均一、微菌核產(chǎn)量及生物量顯著下降等�！鱮ho2與野生型相比無(wú)顯著性差異。上述結(jié)果表明,rho1和rho3對(duì)于微菌核形成是必要的,而rho2基因缺失不影響微菌核的形成。(4)萊氏野村菌rho基因表達(dá)模式分析采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR對(duì)rho X基因表達(dá)模式進(jìn)行分析表明3個(gè)基因在微菌核發(fā)育的不同時(shí)期均有表達(dá),其中rho1在3.5d表達(dá)量最高,在5d時(shí)急劇下降,與此同時(shí),rho2和rho3的表達(dá)量在5d達(dá)到最高,與1.5d相比,分別提高11.05倍6.47倍。因此,rho1在微菌核開(kāi)始形成時(shí)期高量表達(dá),而rho2和rho3則在微菌核成熟時(shí)期高量表達(dá),表明rho X基因各自參與到微菌核發(fā)育過(guò)程的不同時(shí)期,具有時(shí)序性表達(dá)的特點(diǎn)。對(duì)缺失突變體進(jìn)行表達(dá)模式分析表明,3.5d時(shí),rho1缺失導(dǎo)致rho2表達(dá)量顯著提高6.56倍,rho3缺失導(dǎo)致rho1表達(dá)量降低64.82%,與此同時(shí),△rho2中,rho1和rho3的轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)平穩(wěn),未呈現(xiàn)明顯差異。在微菌核成熟時(shí)期(5d),rho1缺失后,rho2和rho3的轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)平穩(wěn),△rho2中,rho1和rho3的轉(zhuǎn)錄水平無(wú)顯著變化,而rho3缺失后,rho1表達(dá)量提高2.15倍。(5)缺失突變株致病性分析通過(guò)體表點(diǎn)滴和體內(nèi)注射方式進(jìn)行毒力測(cè)定,結(jié)果顯示:rho1敲除突變株的半致死時(shí)間(LT50)分別為11.5d、10.06d,較野生型菌株顯著延遲2.43d、1.9d,△rho2、△rho3與野生型無(wú)顯著差異。上述結(jié)果表明:rho1缺失使菌株毒力顯著降低,而rho2、rho3基因缺失不影響萊氏野村菌對(duì)斜紋夜蛾三齡幼蟲(chóng)的致病力。綜上所述,通過(guò)基因敲除的方式,對(duì)Rho家族基因的生物學(xué)功能進(jìn)行了研究,揭示了Rho1、Rho2、Rho3基因在調(diào)控產(chǎn)孢、萌發(fā)、形態(tài)發(fā)育、兩型轉(zhuǎn)換、抵抗逆境脅迫、微菌核形成、侵染致病等過(guò)程中各自發(fā)揮不同程度的作用。三個(gè)基因之間存在功能冗余現(xiàn)象,如Rho1缺失之后會(huì)刺激其他基因補(bǔ)償性轉(zhuǎn)錄激活,一定程度上彌補(bǔ)其功能的缺失。以上結(jié)果體現(xiàn)了Rho基因家族之間既有功能多樣性,又存在功能互補(bǔ)性,為昆蟲(chóng)病原真菌Rho基因家族的功能研究了提供科學(xué)依據(jù),對(duì)Rho基因家族的交互功能分析及具體調(diào)控機(jī)制有待進(jìn)一步研究探討。
【圖文】：

克隆與分析 家族基因克隆及結(jié)構(gòu)分析錄組數(shù)據(jù)庫(kù) Unigene 序列及其功能注釋，設(shè)計(jì)引物，分別以因組 DNA 為模板進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳顯示（一的條帶，，與預(yù)測(cè)目標(biāo)片段長(zhǎng)度基本一致。測(cè)序后在 Gen現(xiàn)與其他物種的 Rho GTPase 序列具有很高的相似性，初步，依次命名為 NrRho1，NrRho2、NrRho3，GenBank 登、KU948935、KU948936，全長(zhǎng) cDNA 序列見(jiàn)附錄 D。RF finder 預(yù)測(cè)、cDNA 序列和基因序列比對(duì)分析表明：Nrbp，編碼 268 個(gè)氨基酸，含有 2 個(gè)內(nèi)含子，長(zhǎng)度分別為 53放閱讀框?yàn)?603bp，編碼 200 個(gè)氨基酸，含有 3 個(gè)內(nèi)含子，3bp 和 63bp；NrRho3 開(kāi)放閱讀框?yàn)?651bp，編碼 216 個(gè)氨基長(zhǎng)度分別為 111bp、87bp、99bp 和 59bp。

33圖 3.2 FPNI-PCR 擴(kuò)增 Rho 基因上下游序列（A）FPNI-PCR 第一輪擴(kuò)增產(chǎn)物；（B）FPNI-PCR 第二輪擴(kuò)增產(chǎn)物；（C）FPNI-PCR 第三輪擴(kuò)增產(chǎn)物；Ⅰ：Rho1 3′端；Ⅱ：Rho1 5′端；Ⅲ：Rho2 5′端；Ⅳ：Rho3 3′端；Ⅴ：Rho35′端；M：DNAmarker BM5000；泳道 1-9：FP1-FP9 引物Figure 3.4Amplification of flanking sequence of Rho genes using FPNI-PCR.A：PCR results of primary reaction；B：PCR results of secondary reaction；C：PCR results oftertiary reaction；M1：DNAmarker BM5000；Ⅰ：3′region of Rho1；Ⅱ：5′region of Rho1；Ⅲ：5′region of Rho2；Ⅳ：3′region of Rho3；Ⅴ：5′region of Rho3；M：DNAmarker BM5000；Lane1-Lane9: FP1-FP9 primers
【學(xué)位授予單位】：重慶大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S476.12

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本文編號(hào)：2538096