【摘要】：幾丁質(zhì)是由N-乙酰葡萄糖胺殘基通過β-1,4糖苷鍵連接而成的直連多糖高聚物,主要存在于昆蟲的外骨骼、圍食膜、腸道和氣管以及植物和真菌的細(xì)胞壁中,是自然界中僅次于纖維素的第二大生物多聚物。昆蟲幾丁質(zhì)降解酶主要分為糖苷水解酶18家族的幾丁質(zhì)酶(Chitinase,Cht)和糖苷水解酶20家族的N-乙酰氨基葡萄糖苷酶(N-Acetylglucosaminidase,NAG)兩種,這兩種酶通過協(xié)同作用可將幾丁質(zhì)降解為N-乙酰氨基葡萄糖單體。幾丁質(zhì)酶是一種內(nèi)切酶,可降解幾丁質(zhì)為幾丁寡糖,而N-乙酰氨基葡萄糖苷酶是一種外切酶,可將幾丁寡糖從非還原端水解為N-乙酰氨基葡萄糖單體。幾丁質(zhì)降解酶廣泛存在于昆蟲的中腸、蛻皮液以及一些昆蟲的毒腺中,對(duì)昆蟲生長(zhǎng)發(fā)育過程中幾丁質(zhì)的代謝起著重要的調(diào)控作用。幾丁質(zhì)酶和N-乙酰氨基葡萄糖苷酶作為潛在的殺蟲劑靶標(biāo)、幾丁質(zhì)生物垃圾的降解和生產(chǎn)N-乙酰氨基葡萄糖的酶工具而受到廣泛的關(guān)注。本研究主要是將飛蝗Ⅰ型幾丁質(zhì)酶(LmCht5-1和LmCht5-2)和N-乙酰氨基葡萄糖苷酶(LmNAG1)通過Bac-to-Bac桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)在SF9細(xì)胞中進(jìn)行異質(zhì)性表達(dá),測(cè)定溫度和pH對(duì)酶活性的影響,以及酶的動(dòng)力學(xué)參數(shù)。并通過膠狀幾丁質(zhì)結(jié)合實(shí)驗(yàn)比較LmCht5-1和LmCht5-2對(duì)膠狀幾丁質(zhì)的結(jié)合能力,從而確定幾丁質(zhì)結(jié)合結(jié)構(gòu)域(CBD)的功能。主要研究?jī)?nèi)容分為以下三個(gè)部分:一、飛蝗LmCht5-1、LmCht5-2和LmNAG1在Bac-to-Bac桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)中的表達(dá)及純化將飛蝗Ⅰ型幾丁質(zhì)酶(LmCht5-1和LmCht5-2)和N-乙酰氨基葡萄糖苷酶(LmNAG1)通過Bac-to-Bac桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)在SF9細(xì)胞中進(jìn)行異質(zhì)性表達(dá)。設(shè)計(jì)帶有酶切位點(diǎn)、起始密碼子、終止密碼子以及6×His標(biāo)簽的PCR引物擴(kuò)增目的片段,構(gòu)建到pFastbacTM Dual真核表達(dá)載體上,之后將重組載體轉(zhuǎn)化到DH10感受態(tài)細(xì)胞中,得到重組Bacmid桿粒,將重組Bacmid桿粒轉(zhuǎn)染SF9細(xì)胞進(jìn)行真核表達(dá)。利用6×His標(biāo)簽蛋白與Ni-NTA柱的親和性對(duì)所表達(dá)蛋白進(jìn)行純化。通過SDS-PAGE膠和Western Blot對(duì)純化后的目的蛋白進(jìn)行檢測(cè)。二、飛蝗幾丁質(zhì)降解酶的酶學(xué)特性分析獲得純化蛋白后,測(cè)定了酶的最適pH、pH穩(wěn)定性、最適溫度、熱穩(wěn)定性以及酶的動(dòng)力學(xué)參數(shù)等。結(jié)果顯示LmCht5-1和LmCht5-2具有相似的最適pH和溫度(使用寡聚底物4MU-(GlcNAc)3時(shí),二者的最適pH值為6,使用多聚底物CM-Chitin-RBV時(shí)二者的最適pH值均為9,最適溫度為40℃)。使用寡聚底物4MU-(GlcNAc)3測(cè)定酶的動(dòng)力學(xué)參數(shù)時(shí),LmCht5-1的Km值比LmCht5-2小,LmCht5-1的Kcat/Km值比LmCht5-2大,相反,使用多聚底物CM-Chitin-RBV測(cè)定酶的動(dòng)力學(xué)參數(shù)時(shí),LmCht5-1的Km值比LmCht5-2大,LmCht5-1的Vmax/Km值比LmCht5-2小,說明LmCht5-1傾向于水解寡聚底物,而LmCht5-2則傾向于水解多聚底物。使用4MU-GlcNAc為底物測(cè)定LmNAG1的動(dòng)力學(xué)參數(shù)時(shí),LmNAG1的Km值為0.28±0.02mM,kcat/Km值為3215.12±61.98 mM-1S-1,說明LmNAG1酶對(duì)底物4MU-GlcNAc有著很高的親和性,且具有很高的催化效率。所以我們得出結(jié)論:在蝗蟲體內(nèi),LmCht5-1可能主要負(fù)責(zé)降解寡聚幾丁質(zhì),LmCht5-2可能主要負(fù)責(zé)降解多聚幾丁質(zhì),而LmNAG1主要負(fù)責(zé)將LmCht5-1和LmCht5-2的降解產(chǎn)物通過外切水解作用降解為N-乙酰氨基葡萄糖單體。三、LmCht5-1和LmCht5-2的幾丁質(zhì)結(jié)合特性分析LmCht5-1和LmCht5-2在結(jié)構(gòu)上都具有信號(hào)肽、一個(gè)催化域和一個(gè)連接區(qū),此外LmCht5-1比LmCht5-2多一個(gè)CBD區(qū)(Chitin binding domain)。本研究通過Arakane等[1]所描述的幾丁質(zhì)結(jié)合特性研究方法對(duì)飛蝗幾丁質(zhì)酶LmCht5-1和LmCht5-2的幾丁質(zhì)結(jié)合特性進(jìn)行了研究,得出結(jié)論:含有CBD區(qū)的LmCht5-1可以和膠狀幾丁質(zhì)緊密結(jié)合,而不含CBD區(qū)的LmCht5-2則幾乎不能結(jié)合膠狀幾丁質(zhì)。本研究首次將飛蝗Ⅰ型幾丁質(zhì)酶(LmCht5-1和LmCht5-2)和β-N-乙酰葡萄糖苷酶(LmNAG1)構(gòu)建于真核表達(dá)載體上進(jìn)行表達(dá)和純化,并對(duì)純化蛋白進(jìn)行了最適pH、pH穩(wěn)定性、最適溫度、熱穩(wěn)定性以及酶反應(yīng)動(dòng)力學(xué)參數(shù)的測(cè)定。進(jìn)一步明確了LmCht5-1、LmCht5-2和LmNAG1的理化特性,為利用幾丁質(zhì)降解酶進(jìn)行害蟲防治提供了理論依據(jù)。
【圖文】：

－邐」ｎ逡逑圖１－１幾下質(zhì)的化學(xué)結(jié)構(gòu)逡逑Ｆｉｇ．邋１－１邋Ｔｈｅ邋ｃｈｅｍｉｃａｌ邋ｓｔｒｕｃ化ｉ＊ｅ邋ｏｆ邋ｃｈｉｔｉｎ逡逑幾Ｔ質(zhì)又名殼多糖，是由Ｎ－己憸葡萄糖胺殘基通過ｐ－ｌ，４糖昔鍵連接而成的逡逑直連多糖高聚物（圖１－１），是自然界含量?jī)H次與纖維素的第二大生物高聚物逡逑幾Ｔ質(zhì)廣泛存在于線蟲的卵壁、真菌的細(xì)胞壁、節(jié)肢動(dòng)物的外骨骼及圍食膜中Ｐ’逡逑１逡逑

修飾Ｗ及配子結(jié)合，在脊椎動(dòng)物中參與糖復(fù)合物代謝。逡逑通過對(duì)昆蟲的Ｐ－Ｎ－乙憸葡萄糖昔酶（ＮＡＧｓ）進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析，可將Ｐ－Ｎ－逡逑己憸葡萄糖昔酶分為五大類［ｗ］（圖１－３）：逡逑Ｉ型ＮＡＧ酶：飛蠟ＬｍＮＡＧｌ屬于這一類型的水解酶，該類酶主要參與幾逡逑Ｔ質(zhì)降解過程。逡逑ＩＩ型ＮＡＧ酶：該類酶與Ｉ型ＮＡＧ酶的功能類似，具有幾Ｔ質(zhì)降解活性。逡逑ＩＩＩ型ＮＡＧ酶：該類酶主要負(fù)責(zé)糖復(fù)合物代謝、配子結(jié)合Ｗ及Ｎ－糖基化修飾逡逑等。逡逑ＩＶ型ＮＡＧ酶：該類型酶又稱為（３－Ｎ－乙憸己糖胺酶（Ｈｅｘｏｓａｍｉｎｉｄａｓｅｓ，ＨＥＸｓ），逡逑主要負(fù)責(zé)幾Ｔ質(zhì)中Ｐ－糖巧鍵連接的Ｐ－Ｎ－乙憸半s前泛停校危覒溒咸煙前返乃義轄�。辶x希中停危粒敲福焊美嗝贛直懷莆ǎ常危溎誶邪被咸煙俏裘稿義希ǎ澹睿洌錚校危幔悖澹簦歟紓歟酰悖錚螅幔恚椋睿椋洌幔螅�，邋ＥＮ矿），，具有恼r興餉富钚�。辶x希危粒侵饕斡?xùn)V搶コ婕噶酥實(shí)慕到�，而且觾磁很强的捂y痔匾煨�，所Ｗ繎亓x希歟椋鈴澹危粒俏ケ晟杓婆┮├唇瀉Τ娣樂巍Ｍü噶酥拭負(fù)停危粒切饔每剎義仙糜詮槍亟諮�、房r怨亟諮字瘟坪褪稱誹砑蛹戀模危簯湴被咸翹塹ヌ�，辶x轄藪蟮木瞇б�。辶x希村義

本文編號(hào)：2537760