【摘要】：鼠疫是由鼠疫耶爾森氏菌(以下簡(jiǎn)稱鼠疫菌)引起的一種自然疫源性烈性傳染病,歷史上曾發(fā)生過三次人間鼠疫大流行引起數(shù)以億計(jì)的人死亡,給人類帶來巨大的災(zāi)難。鼠疫可經(jīng)過跳蚤等節(jié)肢動(dòng)物的叮咬從而傳染給人類,且如果沒有得到及時(shí)治療,可發(fā)展為敗血癥或可通過空氣傳播的肺鼠疫。故鼠疫在我國(guó)被規(guī)定為甲類傳染病。此外,鼠疫菌又是一種生物戰(zhàn)劑和恐怖劑,威脅著人類的安全。因此鼠疫的防治對(duì)人民健康安全、經(jīng)濟(jì)發(fā)展和社會(huì)穩(wěn)定依然具有重要意義。在我國(guó),Yep-phi主要用于鼠疫菌的診斷,且屬于T 7類家族。隨著多重耐藥菌株的出現(xiàn),使噬菌體治療得以重新重視。宿主菌與噬菌體“共進(jìn)化”生活方式也是研究病原菌和宿主相互作用的理想模型。前期工作中,由青海地方病控制所使用鼠疫弱毒菌614F,在Yep-phi噬菌體壓力下連續(xù)培養(yǎng),誘導(dǎo)出對(duì)Yep-phi具有抗性的突變株614F-S43。將614F-S43與共傳代的614F的基因比對(duì),發(fā)現(xiàn)waaA,ail,cmk基因發(fā)生突變�，F(xiàn)在201菌株對(duì)這三個(gè)基因進(jìn)行無痕修飾,并進(jìn)行相關(guān)的表型實(shí)驗(yàn),論證該三個(gè)基因在噬菌體抗性中的發(fā)揮的作用。首先通過在鼠疫菌中建立無痕修飾技術(shù)平臺(tái),分別對(duì)waaA,ail,cmk三個(gè)基因進(jìn)行單基因修飾,兩兩基因修飾和三基因修飾,得到7株突變株。分別是waaA(△9nt),cmk(△10nt),ail(△A),waaA(△9nt)/cmk(△10nt),waaA(△9nt)/ail(△A),cmk(△10nt)/ail(△A)和waaA(△9nt)/cmk(△10nt)/ail(△A)。通過菌株與噬菌體的相關(guān)表型實(shí)驗(yàn),主要測(cè)定噬菌體對(duì)修飾菌株的感染能力、吸附能力、成斑能力,我們發(fā)現(xiàn)waaA(△9nt)的抗噬菌體能力與△waaA相同,并且強(qiáng)于野生型。通過提取LPS,發(fā)現(xiàn)waaA缺失9個(gè)堿基后鼠疫菌LPS的結(jié)構(gòu)受到破壞。通過蛋白信息學(xué)的分析和圓二色光譜的驗(yàn)證,WaaA(△9nt)蛋白比WaaA蛋白相比,結(jié)構(gòu)發(fā)生改變,α螺旋增多,β折疊減少。通過PDB庫(kù)比對(duì),超嗜熱菌WaaA蛋白與鼠疫菌WaaA蛋白同源性較高,且發(fā)現(xiàn)超嗜熱菌中缺失位置為WaaA蛋白與脂質(zhì)A前體的磷酸基團(tuán)結(jié)合的位置,所以我們推測(cè)鼠疫菌中waaA的9個(gè)堿基缺失導(dǎo)致WaaA不能與脂質(zhì)A前體共價(jià)結(jié)合,LPS結(jié)構(gòu)不完整,從而可以抑制噬菌體通過LPS吸附宿主菌。由EditSeq軟件分析和LC-MS/MS結(jié)果說明cmk的10個(gè)堿基缺失后,導(dǎo)致翻譯提前終止,產(chǎn)生不完整蛋白,導(dǎo)致CMP/dCMP不能合成CDP/dCDP,影響宿主的Yep-phi不能獲得CTP或dCTP作為噬菌體DNA聚合酶的底物,影響DNA的復(fù)制,從而起到抗噬菌體的作用。在cmk(△10nt)中構(gòu)建Cmk蛋白過表達(dá)載體,抗噬菌體的能力下降,說明cmk缺失確與噬菌體抗性相關(guān)。ail(△A)的抗噬菌體能力也與△ail一致。但是相比于cmk,waaA,ail的抗噬菌體能力最弱,但是ail卻是最后發(fā)生突變。由于耐受菌與噬菌體相互作用時(shí),我們?nèi)藶楦深A(yù)耐受菌的生長(zhǎng),確保每代耐受菌在噬菌體的培養(yǎng)壓力之前生長(zhǎng)狀態(tài)良好。26℃培養(yǎng)條件下,生長(zhǎng)曲線結(jié)果也顯示cmk(△10nt)/ail(△A)生長(zhǎng)速度遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于ail(△A)和野生株水平。所以我們推測(cè)ail突變發(fā)生是一種適應(yīng)性消耗(fitness cost)后的補(bǔ)償性突變。它不僅能抑制噬菌體對(duì)其吸附,而且在共生存狀態(tài)下,對(duì)于菌體恢復(fù)自身的生長(zhǎng)有重要作用。本研究將waaA基因的重要性定位于三個(gè)氨基酸,從面到點(diǎn)推進(jìn)waaA與噬菌體耐受的研究。驗(yàn)證了cmk的缺失會(huì)起到抗噬菌體的作用,而且作用能力很強(qiáng),能耐受107 PFU的噬菌體。且推測(cè)ail的作用不止是Yep-phi特異性受體,而且是一種適應(yīng)性消耗后的補(bǔ)償性突變,與菌株自身恢復(fù)生長(zhǎng)有很大關(guān)系。本研究結(jié)果在病原-宿主相互作用的層面,解析鼠疫菌和噬菌體這對(duì)矛盾體在噬菌體裂解構(gòu)成中的復(fù)雜變化,不僅可以加深我們對(duì)于鼠疫菌的認(rèn)識(shí),也詮釋了噬菌體壓力下鼠疫菌適應(yīng)性消耗的進(jìn)化過程。
【圖文】：

圖 1 噬菌體的復(fù)制周期Fig 1 Phage replication cycle體實(shí)驗(yàn)仍是鑒定鼠疫菌的重要方法。鼠疫噬菌體根據(jù)其、抗原性和隨對(duì)鼠疫菌的特異性水平的不同，，將其分最多且最為常見，以烈性診斷用噬菌體為代表。包括ph包括 33 株噬菌體。它們具有等距六角形頭部和一個(gè)短尾部，故也屬于短尾噬菌體科（Podoviridae），C1 形現(xiàn)，血清型 1 噬菌體能特異性裂解 74 100%的鼠疫菌、菌（Yersinia pseudotuberculosis, 以下簡(jiǎn)稱假結(jié)核菌）菌（Yersinia enterocolitica）、大腸埃希菌（E. coli）。志賀菌

5圖 2 四株噬菌體基因組結(jié)構(gòu)比較[18]Fig 2 Common genes of lytic Y. pestis phages灰色箭頭為共有基因，黑色箭頭為某些噬菌體特有基因。4. 本研究的目的和意義鼠疫噬菌體因?qū)λ拗鞯母叨忍禺愋院兔舾行�，故在臨床診斷和流行病學(xué)上有重要的價(jià)值與意義。1915 年，就有學(xué)者使用噬菌體來治療鼠疫，但是隨著抗生素的出現(xiàn)，噬菌體的研究治療中斷了，而美國(guó)又將抗生素的生產(chǎn)研究推到一個(gè)更高的高度。但是近年來 隨著多重耐藥鼠疫菌的出現(xiàn)，使人類的健康又面臨巨大
【學(xué)位授予單位】：安徽醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R378.61


本文編號(hào)：2535415