【摘要】：細胞凋亡在生物體的生命活動中扮演著重要角色,其過程受到眾多基因調(diào)控。其中,API5(Apoptosis inhibitor-5)是一種新發(fā)現(xiàn)的細胞凋亡抑制因子,能有效阻斷細胞凋亡進程,但其結構與已知的細胞凋亡抑制蛋白(Inhibitors of apoptosis,IAPs)并不相同。目前有關API5的研究主要集中在人類癌癥相關等方面,因其高水平表達可促進癌細胞發(fā)生而倍受關注。通過基因序列的比對分析,在家蠶(Bombyx mori)基因組中發(fā)現(xiàn)存在該蛋白的同源基因BmAPI5(Gen Bank編號:XM_004927989),但其在家蠶體內(nèi)的功能與作用至今尚未見有報道。本文從家蠶中克隆獲得BmAPI5基因全長c DNA序列,并在對該基因及其蛋白序列作生物信息學分析的基礎上,開展基因的時空表達分析以及對家蠶細胞凋亡的影響等研究,獲得主要結果如下:1.家蠶BmAPI5基因克隆與表達克隆獲得家蠶BmAPI5基因全長c DNA序列,其開放閱讀框長1,671 bp,編碼557個氨基酸殘基,蛋白分子量63.13 k D,等電點6.09。BmAPI5蛋白主要由α-螺旋和無規(guī)則卷曲構成,具有Lxx LL基序和亮氨酸拉鏈等特征結構域。家蠶BmAPI5與黑腹果蠅和人類同源基因Aac11的氨基酸序列相似性分別為46%和47%。將家蠶BmAPI5開放閱讀框序列克隆至原核表達載體p ET-32a中,經(jīng)大腸桿菌(Escherichia coli)誘導表達獲得重組BmAPI5蛋白,并制備其兔多克隆抗體。2.家蠶BmAPI5基因時空表達分別采用實時熒光定量PCR技術和Western雜交技術分析家蠶BmAPI5基因在不同發(fā)育時期、不同組織以及微生物感染后的轉錄與表達水平。BmAPI5基因在家蠶卵、幼蟲和蛹中均有不同程度的轉錄和表達,其中以5齡幼蟲的轉錄水平顯著為高。在不同組織中,BmAPI5以脂肪體中的轉錄和表達水平顯著較高。家蠶核型多角體病毒(Bombyx mori nucleopolyhedrovirus,Bm NPV)和大腸桿菌侵染均能快速顯著誘導BmAPI5基因的轉錄與表達,其中以Bm NPV的誘導作用較為明顯。這表明BmAPI5可能參與Bm NPV-宿主的互作機制。3.家蠶BmAPI5對細胞凋亡的影響在家蠶Bm N細胞中分別構建BmAPI5過表達和抑制表達體系的基礎上,分別采用流式細胞技術和Caspase活性檢測技術分析BmAPI5表達變化對家蠶細胞凋亡的影響。流式細胞儀檢測結果表明,在家蠶Bm N細胞中過量表達BmAPI5基因可顯著降低經(jīng)PBS饑餓誘導的細胞凋亡水平;而抑制表達該基因則可導致PBS饑餓誘導的細胞凋亡水平顯著較高。對不同處理的Caspase活性檢測結果與流式細胞儀檢測結果一致。這表明BmAPI5具有抑制細胞凋亡的功能。本文研究結果不僅可為進一步研究BmAPI5調(diào)控細胞凋亡的分子機制提供基礎,還能為探明BmAPI5在家蠶-桿狀病毒互作中的功能作用以及用于家蠶抗病毒防治提供新思路。
【圖文】：

3.1 家蠶 BmAPI5 的 RT-PCR 產(chǎn)物分ig. 3.1 RT-PCR product analysis of BmAA 蛋白分子量標準; 1: BmAPI5 PCR 擴NA Ladder; 1: BmAPI5 amplified bands o息學分析放閱讀框全長 1,671bp，編碼 557 個圖 3.2）。

浙江理工大學碩士學位論文 家蠶細胞凋亡抑制因子 BmAPI5 基因克隆與功能研利用 ProtScale 軟件對 BmAPI5 進行疏水性分析，，發(fā)現(xiàn)其 N 端和 C 端具有較強的親水性（圖 3.3）。
【學位授予單位】：浙江理工大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：S881.2;Q78

【參考文獻】

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本文編號：2532135