【摘要】：細(xì)胞凋亡在生物體的生命活動(dòng)中扮演著重要角色,其過(guò)程受到眾多基因調(diào)控。其中,API5(Apoptosis inhibitor-5)是一種新發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞凋亡抑制因子,能有效阻斷細(xì)胞凋亡進(jìn)程,但其結(jié)構(gòu)與已知的細(xì)胞凋亡抑制蛋白(Inhibitors of apoptosis,IAPs)并不相同。目前有關(guān)API5的研究主要集中在人類(lèi)癌癥相關(guān)等方面,因其高水平表達(dá)可促進(jìn)癌細(xì)胞發(fā)生而倍受關(guān)注。通過(guò)基因序列的比對(duì)分析,在家蠶(Bombyx mori)基因組中發(fā)現(xiàn)存在該蛋白的同源基因BmAPI5(Gen Bank編號(hào):XM_004927989),但其在家蠶體內(nèi)的功能與作用至今尚未見(jiàn)有報(bào)道。本文從家蠶中克隆獲得BmAPI5基因全長(zhǎng)c DNA序列,并在對(duì)該基因及其蛋白序列作生物信息學(xué)分析的基礎(chǔ)上,開(kāi)展基因的時(shí)空表達(dá)分析以及對(duì)家蠶細(xì)胞凋亡的影響等研究,獲得主要結(jié)果如下:1.家蠶BmAPI5基因克隆與表達(dá)克隆獲得家蠶BmAPI5基因全長(zhǎng)c DNA序列,其開(kāi)放閱讀框長(zhǎng)1,671 bp,編碼557個(gè)氨基酸殘基,蛋白分子量63.13 k D,等電點(diǎn)6.09。BmAPI5蛋白主要由α-螺旋和無(wú)規(guī)則卷曲構(gòu)成,具有Lxx LL基序和亮氨酸拉鏈等特征結(jié)構(gòu)域。家蠶BmAPI5與黑腹果蠅和人類(lèi)同源基因Aac11的氨基酸序列相似性分別為46%和47%。將家蠶BmAPI5開(kāi)放閱讀框序列克隆至原核表達(dá)載體p ET-32a中,經(jīng)大腸桿菌(Escherichia coli)誘導(dǎo)表達(dá)獲得重組BmAPI5蛋白,并制備其兔多克隆抗體。2.家蠶BmAPI5基因時(shí)空表達(dá)分別采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)和Western雜交技術(shù)分析家蠶BmAPI5基因在不同發(fā)育時(shí)期、不同組織以及微生物感染后的轉(zhuǎn)錄與表達(dá)水平。BmAPI5基因在家蠶卵、幼蟲(chóng)和蛹中均有不同程度的轉(zhuǎn)錄和表達(dá),其中以5齡幼蟲(chóng)的轉(zhuǎn)錄水平顯著為高。在不同組織中,BmAPI5以脂肪體中的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)水平顯著較高。家蠶核型多角體病毒(Bombyx mori nucleopolyhedrovirus,Bm NPV)和大腸桿菌侵染均能快速顯著誘導(dǎo)BmAPI5基因的轉(zhuǎn)錄與表達(dá),其中以Bm NPV的誘導(dǎo)作用較為明顯。這表明BmAPI5可能參與Bm NPV-宿主的互作機(jī)制。3.家蠶BmAPI5對(duì)細(xì)胞凋亡的影響在家蠶Bm N細(xì)胞中分別構(gòu)建BmAPI5過(guò)表達(dá)和抑制表達(dá)體系的基礎(chǔ)上,分別采用流式細(xì)胞技術(shù)和Caspase活性檢測(cè)技術(shù)分析BmAPI5表達(dá)變化對(duì)家蠶細(xì)胞凋亡的影響。流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果表明,在家蠶Bm N細(xì)胞中過(guò)量表達(dá)BmAPI5基因可顯著降低經(jīng)PBS饑餓誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡水平;而抑制表達(dá)該基因則可導(dǎo)致PBS饑餓誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡水平顯著較高。對(duì)不同處理的Caspase活性檢測(cè)結(jié)果與流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果一致。這表明BmAPI5具有抑制細(xì)胞凋亡的功能。本文研究結(jié)果不僅可為進(jìn)一步研究BmAPI5調(diào)控細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制提供基礎(chǔ),還能為探明BmAPI5在家蠶-桿狀病毒互作中的功能作用以及用于家蠶抗病毒防治提供新思路。
【圖文】：

3.1 家蠶 BmAPI5 的 RT-PCR 產(chǎn)物分ig. 3.1 RT-PCR product analysis of BmAA 蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn); 1: BmAPI5 PCR 擴(kuò)NA Ladder; 1: BmAPI5 amplified bands o息學(xué)分析放閱讀框全長(zhǎng) 1,671bp，編碼 557 個(gè)圖 3.2）。

浙江理工大學(xué)碩士學(xué)位論文 家蠶細(xì)胞凋亡抑制因子 BmAPI5 基因克隆與功能研利用 ProtScale 軟件對(duì) BmAPI5 進(jìn)行疏水性分析，，發(fā)現(xiàn)其 N 端和 C 端具有較強(qiáng)的親水性（圖 3.3）。
【學(xué)位授予單位】：浙江理工大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類(lèi)號(hào)】：S881.2;Q78

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2532135