【摘要】：維生素B6(Vitamin B6,VB6)是維持機(jī)體正常生理代謝活動(dòng)所必需的重要營養(yǎng)素,其主要的生物活性形式為磷酸吡哆醛(Pyridoxal-5’-phosphate,PLP),參與體內(nèi)氨基酸、糖原、神經(jīng)遞質(zhì)、鞘磷脂、血紅素和核酸的合成與代謝。吡哆醛激酶(Pyridoxal kinase,Pdx K)和磷酸吡哆醇氧化酶(Pyridoxine 5’-phosphate oxidase,PNPO)是PLP的合成酶,在磷酸酶的共同作用下調(diào)節(jié)著細(xì)胞、血漿和組織內(nèi)PLP的動(dòng)態(tài)平衡。細(xì)胞內(nèi)PLP的缺乏會(huì)引起嚴(yán)重的神經(jīng)系統(tǒng)疾病,而過量的PLP會(huì)對(duì)機(jī)體產(chǎn)生毒性作用,導(dǎo)致運(yùn)動(dòng)和感覺神經(jīng)出現(xiàn)障礙。因此,細(xì)胞內(nèi)Pdx K和PNPO的活性必須受到嚴(yán)格調(diào)控,以滿足新合成的缺輔基酶對(duì)PLP的動(dòng)態(tài)需求。Pdx K和PNPO的活性調(diào)節(jié)可以發(fā)生在結(jié)構(gòu)水平上,也可以發(fā)生在合成水平上。目前,研究人員已從大腸桿菌、植物、昆蟲和哺乳動(dòng)物中鑒定出Pdx K和PNPO,闡明了Pdx K和PNPO的晶體結(jié)構(gòu)、活性調(diào)節(jié)機(jī)制和不同底物下的酶動(dòng)力學(xué)特征。蛋白質(zhì)是基因表達(dá)的產(chǎn)物,轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控是基因表達(dá)過程中重要的環(huán)節(jié)。啟動(dòng)子控制著基因轉(zhuǎn)錄的起始和頻率,是深入理解基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制的關(guān)鍵。人Pdx K和PNPO基因已被克隆和鑒定,但對(duì)其啟動(dòng)子的研究還未見報(bào)道。本研究在生物信息學(xué)分析的基礎(chǔ)上,克隆和構(gòu)建人Pdx K和PNPO基因不同長度的啟動(dòng)子熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒,分析其活性,確定Pdx K和PNPO基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)域。進(jìn)一步對(duì)轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)內(nèi)潛在的順式作用元件進(jìn)行了缺失突變分析,為深入研究Pdx K和PNPO基因的轉(zhuǎn)錄奠定基礎(chǔ)。1.生物信息學(xué)預(yù)測結(jié)果顯示,人Pdx K和PNPO基因的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)分別位于翻譯起始位點(diǎn)上游198bp和153bp(標(biāo)記為+1);綜合啟動(dòng)子預(yù)測軟件的結(jié)果,確定人Pdx K和PNPO基因的基本啟動(dòng)子區(qū)域?yàn)?930~+243和-996~+421,該區(qū)域內(nèi)沒有典型的TATA-box和CAAT-box元件,但是在轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)附近含有多拷貝的GC-box和Cp G島;2.利用Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)特異性引物,以人基因組DNA為模板,PCR擴(kuò)增PdxK和PNPO基因5’端缺失截短片段,連接到含螢火蟲熒光素酶基因的p GL3-basic載體上,構(gòu)建不同長度的啟動(dòng)子-熒光素酶重組質(zhì)粒。雙熒光素酶試驗(yàn)結(jié)果表明,人Pdx K基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)域?yàn)?665~-443,缺失該區(qū)域?qū)?dǎo)致啟動(dòng)子的活性降低66%。人PNPO基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)域?yàn)?996~-851和-412~+85,缺失該區(qū)域會(huì)導(dǎo)致啟動(dòng)子的活性分別降低25.8%和58.1%。3.通過JASPAR和Gene Regulation數(shù)據(jù)庫分析PdxK基因-665~-443轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū),發(fā)現(xiàn)3個(gè)潛在的Sp1和1個(gè)USF結(jié)合位點(diǎn);而PNPO基因-996~-851和-412~+85的轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)發(fā)現(xiàn)多個(gè)Sp1、E2F1和USF結(jié)合位點(diǎn)。設(shè)計(jì)特異性引物擴(kuò)增順式作用元件依次缺失的片段,連接到p GL3-basic載體,構(gòu)建缺失突變重組質(zhì)粒。雙熒光素酶試驗(yàn)結(jié)果顯示,Pdx K基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)內(nèi)的Sp1結(jié)合位點(diǎn)(-552~-542)對(duì)維持其高轉(zhuǎn)錄活性起著重要作用,缺失會(huì)導(dǎo)致啟動(dòng)子活性降低61.1%;而PNPO基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)內(nèi)E2F1(-867~-857)和USF(-69~-59)結(jié)合位點(diǎn)是重要的順式作用元件,缺失將導(dǎo)致啟動(dòng)子的活性分別降低26.7%和32.5%。
【圖文】：

圖 1-1. VB6 化合物的結(jié)構(gòu)及 PLP 補(bǔ)救合成途徑[7]Fig1-1.The structure of B6 vitamers and the PLP salvage pathway.

圖 1-2. 吡哆醛激酶與 Mg-ATP 及 PL 配位復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)示意圖[4bon diagram of the dimer crystal structure of pyridoxal kinase complexed wit性調(diào)節(jié)機(jī)制構(gòu)中包含一個(gè)非�；顫姷娜┗�，能夠與伯胺或仲胺反白標(biāo)簽。細(xì)胞內(nèi)高水平的 PLP 會(huì)產(chǎn)生毒性作用，引起
【學(xué)位授予單位】：安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：Q78

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2526795