【摘要】：CRISPR-Cas9系統(tǒng)是原核生物抵御病毒或質(zhì)粒等外來(lái)遺傳物質(zhì)入侵的一種獲得性免疫系統(tǒng),主要由非特異性Cas9核酸酶和起識(shí)別作用的crRNA組成。該系統(tǒng)自2012年首次證明可以在體外對(duì)DNA進(jìn)行基因編輯,現(xiàn)已成功地應(yīng)用于不同物種的基因編輯中。作為一種新型的基因編輯技術(shù),該技術(shù)具有簡(jiǎn)單、快速、高效等優(yōu)點(diǎn)。目前該技術(shù)已成功的應(yīng)用于多種物種的基因敲除、gRNA文庫(kù)的建立及動(dòng)物疾病模型的構(gòu)建等。骨唾液酸蛋白(bone sialoprotein,BSP)是骨基質(zhì)中一種高度磷酸化和糖基化的分泌性蛋白,在腫瘤的粘附、增殖、侵襲、基質(zhì)降解、免疫反應(yīng)(炎癥和補(bǔ)體逃逸)、血管生成等轉(zhuǎn)移相關(guān)的多個(gè)過(guò)程中發(fā)揮重要作用。自1994年Bellahcene首次證實(shí)BSP表達(dá)與乳腺癌骨轉(zhuǎn)移相關(guān),有關(guān)乳腺癌骨轉(zhuǎn)移與BSP的關(guān)系研究取得了明顯進(jìn)展。目前相關(guān)研究報(bào)道中抑制BSP表達(dá)的方法包括反義核酸、BSP抗體及RNA干擾技術(shù),但都只是在轉(zhuǎn)錄后或翻譯水平不同程度地暫時(shí)降低BSP的表達(dá)。因此,本研究擬利用CRISPR-Cas9技術(shù),在轉(zhuǎn)錄水平抑制親骨轉(zhuǎn)移乳腺癌細(xì)胞(231BO)的BSP基因表達(dá),通過(guò)細(xì)胞增殖、克隆形成和細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)初步檢測(cè)細(xì)胞生物學(xué)性質(zhì)變化,為進(jìn)一步研究BSP與乳腺癌骨轉(zhuǎn)移關(guān)系的分子機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。本實(shí)驗(yàn)的主要研究結(jié)果如下:1.成功構(gòu)建表達(dá)Cas9蛋白的親骨轉(zhuǎn)移乳腺癌細(xì)胞(231BO-Cas9)。通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)、Western blot、免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)證實(shí)231BO-Cas9細(xì)胞表達(dá)Cas9蛋白,并且在核定位信號(hào)的引導(dǎo)下能夠進(jìn)入到細(xì)胞核中。2.實(shí)時(shí)無(wú)標(biāo)記動(dòng)態(tài)細(xì)胞分析和劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明Cas9蛋白的表達(dá)對(duì)乳腺癌細(xì)胞的增殖和遷移均無(wú)影響;電鏡觀察發(fā)現(xiàn)231BO-Cas9與231BO細(xì)胞的細(xì)胞膜、細(xì)胞器及細(xì)胞核的結(jié)構(gòu)一致,提示Cas9蛋白表達(dá)對(duì)乳腺癌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)無(wú)影響。3.SURVEYOR檢測(cè)和基因測(cè)序結(jié)果表明針對(duì)BSP的gRNA能夠介導(dǎo)Cas9蛋白對(duì)靶位點(diǎn)進(jìn)行切割,造成BSP基因的插入缺失突變,提示231BO-Cas9細(xì)胞表達(dá)的Cas9蛋白能夠進(jìn)入到細(xì)胞核中并發(fā)揮核酸內(nèi)切酶的作用。4.利用CRISPR-Cas9技術(shù)獲得2株BSP蛋白表達(dá)下降乳腺癌細(xì)胞株(231BO-Cas9-gRNA)。與對(duì)照組細(xì)胞相比,western blot結(jié)果顯示2株231BO-Cas9-gRNA細(xì)胞BSP表達(dá)下降分別為34.5%和36.7%;通過(guò)CCK-8檢測(cè)發(fā)現(xiàn)231BO-Cas9-gRNA細(xì)胞增殖能力下降,細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)提示231BO-Cas9-gRNA細(xì)胞的愈合速度分別降低28%和32.9%;克隆形成實(shí)驗(yàn)顯示231BO-Cas9-gRNA細(xì)胞的克隆形成能力分別降低32.3%和37.2%。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明CRISPR-Cas9介導(dǎo)BSP基因編輯引起B(yǎng)SP蛋白表達(dá)水平下調(diào)后,親骨轉(zhuǎn)移乳腺癌細(xì)胞的增殖、遷移及克隆形成能力均有所下降。
【圖文】：

第一章 緒論、加工與成熟：CRISPR 重復(fù)序列和間隔序列一同經(jīng)轉(zhuǎn)錄加工為 pre-crRNRNA 的重復(fù)序列區(qū)域與 tracrRNAs 配對(duì)雜交，接著由內(nèi)源性的 RNase Ⅲ從列的 5’端裂解雜合的 pre-crRNA-tracrRNAs，產(chǎn)生成熟的 tracrRNA-crRNAs9 核酸內(nèi)切酶結(jié)合[17]；最后，當(dāng)同樣的外源 DNA 再次入侵時(shí)，CRISPR-C雙鏈 DNA 的靶位點(diǎn)結(jié)合并進(jìn)行切割，從而破壞外來(lái)入侵 DNA。靶 DNA的斷裂既需要靶序列和間隔序列之間的互補(bǔ)，又必需靶 DNA 序列的 3’端序列（Protospacer adjacent motif）[18]，PAM 序列的存在同時(shí)還避免了 CRI被作為靶標(biāo)識(shí)別，提供了一個(gè)區(qū)別“異己”和“自己”的機(jī)制。不同來(lái)源的 有不同的PAM序列，最常用的基于產(chǎn)膿鏈球菌CRISPR系統(tǒng)的PAM序列為任意核苷酸[17]。

第一章 緒論生的作用[26]。并且，dCas9 還可以通過(guò)融合各種效應(yīng)因子結(jié)合在特異的基因位點(diǎn)上揮不同的作用。例如，有研究[28-32]將轉(zhuǎn)錄激活子或轉(zhuǎn)錄抑制子融合在 dCas9，可以定基因的表達(dá)進(jìn)行調(diào)節(jié)（圖 1-2A），并且通過(guò)多個(gè) gRNA 介導(dǎo)多個(gè)不同的轉(zhuǎn)錄因子在同一基因位點(diǎn)，有效地提高了基因調(diào)節(jié)的效率，推測(cè)其與轉(zhuǎn)錄因子之間的協(xié)同作關(guān)[15, 28, 29, 32]。也有研究通過(guò) dCas9 融合 eGFP 蛋白來(lái)判斷一段基因序列中是否包含復(fù)序列，，例如端粒[33]（圖 1-2B），gRNA 可特異性識(shí)別重復(fù)序列，若 DNA 位點(diǎn)包重復(fù)序列，則會(huì)通過(guò) dCas9 結(jié)合多個(gè) EGFP 蛋白，該策略為研究染色體的結(jié)構(gòu)和動(dòng)提供了一種有效的方法，并且使 CRISPR-Cas9 系統(tǒng)的應(yīng)用不僅僅局限于基因編輯的。
【學(xué)位授予單位】：華南理工大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R737.9;Q78

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