【摘要】：托品烷類生物堿(Tropane alkaloids,TAs)主要提取自茄科植物,包括莨菪堿(hyoscyamine)、山莨菪堿(anisodamine)和東莨菪堿(scopolamine),而莨菪堿和東莨菪堿是兩種作為抗膽堿藥物而被廣泛應(yīng)用于副交感神經(jīng)系統(tǒng),因而臨床上常應(yīng)用于鎮(zhèn)痛、麻醉、抗暈動藥、治療帕金森癥、改善微循環(huán)、戒毒脫癮、治療農(nóng)藥中毒等。山莨菪堿作為非特異性膽堿受體拮抗劑,其藥理性與莨菪堿相似,然而東莨菪堿與莨菪堿相比較,其在臨床上具有藥效更強(qiáng)而副作用更小的特點(diǎn),因而具有更大的市場價(jià)值。但是在茄科植物中東莨菪堿的含量極低,而利用人工合成的方法其成本太高且困難,因而在茄科植物中,通過代謝工程以獲得高產(chǎn)東莨菪堿的藥用植物將成為我們研究的一個(gè)方向。木本曼陀羅(Brugmansia arborea)屬于茄科(solananaceac)曼陀羅屬(Datura)的植物,根據(jù)前人報(bào)道的文獻(xiàn)可知,木本曼陀羅的東莨菪堿含量極高,其化學(xué)型屬于東莨菪堿型,因而我們以此為研究材料,通過同源物種(Datura stramonium和Datura innoxia)的托品酮還原酶Ⅰ(tropinone reductase I,TRI)基因序列比對,并分析保守區(qū)域的基因序列,利用RACE的方法,從B.arborea中克隆而獲到一條TRI序列,BaTRI全長序列為1138-bp,包括41-bp的5’UTR、278-bp的3’UTR和819-bp的開放性閱讀框(Open Reading Frame,ORF),該編碼區(qū)能編碼272個(gè)氨基酸,通過與其它已知的TRI氨基酸序列進(jìn)行比對分析后,該氨基酸序列具有TRI功能必需的的結(jié)構(gòu)域;通過體外重組技術(shù),并在Rosstar中高效表達(dá)BaTRI,能純化出大小約為30kDa的重組蛋白,與預(yù)測的29.7kDa相一致,同時(shí)為了與已經(jīng)報(bào)道的DsTRI進(jìn)行比較,我們從D.stramonium中克隆并獲得編碼DsTRI基因序列;對重組BaTRI酶動力學(xué)參數(shù)進(jìn)行測定,其結(jié)果顯示:以托品酮作為測定底物時(shí),BaTRI的高還原活性能維持在一個(gè)很寬的pH范圍(從6.8-8.0),而在8.0時(shí)活性最高,當(dāng)以托品作為測定底物時(shí),BaTRI的高氧化活性只能維持在一個(gè)很小的pH范圍,而在9.6時(shí)活性最高。我們以6.4(植物的生理活性pH)作為酶動力學(xué)測定值,BaTRI對托品酮底物的Km、Vmax和Kcat分別為2.65 mM、88.30 nkat.mg-1和2.93 S-1,同時(shí),也對兩種托品酮的底物類似物進(jìn)行了測定:4-甲基環(huán)己酮(4-methylcyclohexanone)和3-奎寧環(huán)酮鹽酸鹽(3-quinuclidinone hydrochloride),它們分別為單列酮和雙環(huán)酮的典型底物,常被用于托品酮還原酶的鑒定。此外,在9.6時(shí)還測定了BaTRI對托品的相關(guān)酶動力學(xué)參數(shù),其Km、Vmax和Kcat分別為0.56 mM、171.62 nkat.mg-1和0.54 S-1,結(jié)果顯示BaTRI對托品的Km小于BaTRI對托品酮Km,但是兩個(gè)反應(yīng)的pH不一樣,BaTRI對托品酮的反應(yīng)處在弱酸性而BaTRI對托品的反應(yīng)卻處在強(qiáng)堿性,當(dāng)在弱酸性范圍時(shí)BaTRI對托品反應(yīng)極低,而植物的生理PH為6.4,說明在B.arborea體內(nèi)主要是還原反應(yīng)占主導(dǎo)優(yōu)勢。為了與DsTRI進(jìn)行酶活性比較,相同條件下,測定了DsTRI對托品酮底物的Km、Vmax和Kcat,它們的值分別為4.18 mM、81.20 nkat.mg-1和2.40 S-1,測定的結(jié)果顯示BaTRI的Km小于DsTRI的Km,說明BaTRI對托品酮的親和力更高,為了更好的說明BaTRI還原活性高于DsTRI,在6.4、6.8和7.0時(shí)同時(shí)測定了BaTRI和DsTRI對5mM托品酮的Kcat,結(jié)果顯示BaTRI在6.4、6.8和7.0時(shí)對5mM托品酮的Kcat都高于DsTRI的Kcat,說明BaTRI對托品酮的催化效率更高,從而顯示BaTRI的活性高于DsTRI;利用qPCR方法研究BaTRI在各組織中的表達(dá)情況,結(jié)果顯示,BaTRI在各組織中都有表達(dá),而在須根中的表達(dá)量最高,其表達(dá)模式與之前我們實(shí)驗(yàn)組所報(bào)道的BaH6H表達(dá)模式相一致,但是與所報(bào)道的幾個(gè)草本物種的表達(dá)模式有很大區(qū)別;利用HPLC分析各組織中TAs的含量,結(jié)果顯示,B.arborea主要含有東莨菪堿,而葉片和莖枝中的含量高于其他部位,說明B.arborea與D.stramonium和Hyoscyamus Niger一樣,其化學(xué)型屬于東莨菪堿型植物。BaTRI的表達(dá)模式和TAs的含量分布說明,在B.arborea中,地下部分是TAs合成的主要場所,地上部分也同時(shí)參與了TAs的合成。本文通過對BaTRI功能驗(yàn)證的研究,可以確定木本曼陀羅托品酮還原酶I的活性很高,為我們以后對TAs合成途徑上的TRI靶位點(diǎn)進(jìn)行改造時(shí),提供一個(gè)更高效的候選基因,以便能得到高產(chǎn)東莨菪堿的藥用植物。
【學(xué)位授予單位】：西南大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：Q943.2

【參考文獻(xiàn)】

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1 龍世平;盧衍;王亞雄;楊春賢;蘭小中;廖志華;;過表達(dá)內(nèi)源PMT和H6H基因?qū)︻嵡寻l(fā)根托品烷類生物堿合成的影響[J];藥學(xué)學(xué)報(bào);2013年02期

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本文編號：2524288