【摘要】：加工番茄作為重要的經(jīng)濟作物之一,具有重要的開發(fā)利用價值,病毒病害是影響加工番茄產(chǎn)量和品質(zhì)的主要病原之一,導(dǎo)致加工番茄減產(chǎn)甚至絕產(chǎn)。新疆加工番茄上主要的病毒包括:To MV、CMV、PVY以及STV,其中CMV和PVY對番茄植株產(chǎn)生嚴(yán)重的危害。RNA沉默是植物自主抵御病毒侵染的主要防御手段,其在植物抗病毒具有重要作用,RNA沉默復(fù)合體(RNA induced silencing complex;RISC)是RNA沉默中的主要元件,可以介導(dǎo)靶基因m RNA的特異性切割,從而達到RNA沉默效果,Argonaute(AGO)蛋白是組成RNA沉默復(fù)合體的核心蛋白,是RNA沉默所必需的。AGO蛋白首次在植物中被發(fā)現(xiàn),是一類高度保守的堿性蛋白,其蛋白家族成員均具有四個結(jié)構(gòu)域,分別為:N端結(jié)構(gòu)域,PIWI結(jié)構(gòu)域,PAZ結(jié)構(gòu)域以及MID結(jié)構(gòu)域。其中PAZ結(jié)構(gòu)域主要識別si RNA 3′端突出的2個堿基,負(fù)責(zé)與RNA結(jié)合;PIWI結(jié)構(gòu)域在結(jié)構(gòu)和功能上與RNase H相似,RISC具有核酸內(nèi)切酶的活性,切割靶基因。AGO蛋白家族成員被分為兩個亞組,分別為AGO亞組和PIWI亞組,不同物種中AGO蛋白家族成員的數(shù)目各不相同,其主要功能也存在較大差異。目前,番茄中已知的AGO蛋白家族成員有八個,其中SlAGO1A和SlAGO1B可能影響植株高度和開花時間,SlAGO7被發(fā)現(xiàn)可能與葉和花器官的形成有關(guān),SlAGO4A被發(fā)現(xiàn)與植物抗逆有關(guān)。目的:本研究以加工番茄AGO4A為研究對象,通過酵母雙雜交驗證其與PVY HC-Pro以及CMV 2b的相互作用;亞細胞定位、過量表達和干擾轉(zhuǎn)基因植株的獲得;為進一步研究其功能提供初步依據(jù)。方法:將SlAGO4A基因與已知功能的AGO蛋白家族成員進行蛋白結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列比對構(gòu)建進化樹,并通過SMART進行蛋白結(jié)構(gòu)域分析。通過Gen Bank中查找SlAGO4A序列以及本實驗室的PVY HC-Pro以及CMV2b序列,利用GAL4酵母雙雜交系統(tǒng)中誘餌載體和目的載體序列設(shè)計引物,構(gòu)建誘餌載體和目的載體,通過酵母雙雜交系統(tǒng)說明書所提供的實驗方法進行酵母雙雜交實驗。根據(jù)SlAGO4A基因序列和亞細胞定位載體序列設(shè)計合成引物,構(gòu)建GFP融合載體,并利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法進行煙草遺傳轉(zhuǎn)化。通過激光共聚焦顯微鏡觀察GFP熒光。通過SlAGO4A基因序列和PIWI蛋白結(jié)構(gòu)域基因序列構(gòu)建過量表達載體和干擾載體,利用農(nóng)桿菌侵染法進行番茄遺傳轉(zhuǎn)化,利用q RT-PCR技術(shù)對過量表達轉(zhuǎn)基因番茄植株進行目的基因的相對表達量分析。結(jié)果:系統(tǒng)發(fā)育分析顯示,SlAGO4A與擬南芥At AGO4氨基酸相似性較高,歸于At AGO4亞組。SlAGO4A具有AGO蛋白家族成員所共有N端結(jié)構(gòu)域、PAZ結(jié)構(gòu)域、MID結(jié)構(gòu)域和PIWI結(jié)構(gòu)域,此外也具有DUF1785和Argo L2結(jié)構(gòu)域。成功構(gòu)建誘餌表達載體BD-CMV 2b、BD-PVY HC-Pro以及目的表達載體AD-SlAGO4A通過GAL4酵母雙雜交系統(tǒng)初步判斷SlAGO4A與PVY HC-Pro和CMV 2b并無相互作用。成功構(gòu)建GFP融合表達載體35S:GFP-SlAGO4A,遺傳轉(zhuǎn)化煙草植株,共獲得5個轉(zhuǎn)基因煙草株系,激光共聚焦顯微鏡觀察結(jié)果表明,SlAGO4A定位于細胞核和保衛(wèi)細胞膜上。成功構(gòu)建過量表達載體35S:SlAGO4A以及干擾載體35S:Ri PIWI,遺傳轉(zhuǎn)化番茄植株,并獲得6株過量表達轉(zhuǎn)基因番茄植株和5株干擾轉(zhuǎn)基因番茄株系,獲得的所有轉(zhuǎn)基因番茄植株中SlAGO4A基因的表達量均有明顯升高,相比正常植株來說增長量大約在6-76×之間波動,證明成功獲得過表達植株。結(jié)論:通過系統(tǒng)發(fā)育結(jié)果我們推測SlAGO4A基因可能與At AGO4功能相似,根據(jù)酵母雙雜交實驗我們初步判斷SlAGO4A與PVY HC-Pro以及CMV2b無相互作用。成功獲得5個GFP融合轉(zhuǎn)基因株系,并通過熒光觀察確定SlAGO4A定位于細胞核和保衛(wèi)細胞膜上,成功獲得6個過量表達及5個干擾轉(zhuǎn)基因番茄株系。為研究其功能奠定基礎(chǔ),有助于深入研究番茄中該基因提供了理論基礎(chǔ)。
文內(nèi)圖片：
圖片說明： 600=0.01；取 2μL 點樣于 SD/-Trp-Leu、SD/-Trp-Leu-His-Ade 平板上，d，觀察結(jié)果。表 2.2 誘餌蛋白和對照檢測質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化組配Table 2 Verification of Bait plasmid suitability for CytoTrap interaction a 結(jié)果與分析.1 PVY HC-Pro、CMV2b 和 SlAGO4A 基因的擴增 質(zhì)粒組合 質(zhì)粒用量 感受BD + AD 100 ng 100μBD + AD-SlAGO4A 100 ng 100μBD-CMV 2b + AD 100 ng 100μBD-CMV 2b + AD-SlAGO4A 100 ng 100μBD PVY-HC-Pro + AD 100 ng 100μBD PVY-HC-Pro + AD-SlAGO4A 100 ng 100μ
文內(nèi)圖片：
圖片說明： 600=0.01；取 2μL 點樣于 SD/-Trp-Leu、SD/-Trp-Leu-His-Ade 平板上，，d，觀察結(jié)果。表 2.2 誘餌蛋白和對照檢測質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化組配Table 2 Verification of Bait plasmid suitability for CytoTrap interaction a 結(jié)果與分析.1 PVY HC-Pro、CMV2b 和 SlAGO4A 基因的擴增 質(zhì)粒組合 質(zhì)粒用量 感受BD + AD 100 ng 100μBD + AD-SlAGO4A 100 ng 100μBD-CMV 2b + AD 100 ng 100μBD-CMV 2b + AD-SlAGO4A 100 ng 100μBD PVY-HC-Pro + AD 100 ng 100μBD PVY-HC-Pro + AD-SlAGO4A 100 ng 100μ
【學(xué)位授予單位】：石河子大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：S641.2

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 趙寧;趙俐杰;;Cdc42小干擾RNA對乳腺癌MCF7細胞增殖的影響[J];遼寧醫(yī)學(xué)院學(xué)報;2016年04期

2 尚仁福;吳立剛;;RNA干擾的機制及其應(yīng)用[J];生命科學(xué);2016年05期

3 周曉馥;宋明霞;王晶;徐洪偉;;植物AGO蛋白的結(jié)構(gòu)預(yù)測分析[J];吉林師范大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版);2015年04期

4 楊曼曼;林玉玲;王天池;賴鐘雄;;龍眼胚性愈傷組織AGO6基因克隆及其在體胚發(fā)生過程中的表達分析[J];江西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報;2015年01期

5 趙文文;韓穎穎;;Argonaute蛋白與小RNA的作用機制[J];中國生物化學(xué)與分子生物學(xué)報;2014年12期

6 馬成川;譚光宏;陽宇;李靈;;SARS冠狀病毒RNA聚合酶基因片段體外組裝和siRNA干擾研究[J];四川大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版);2014年06期

7 李元宏;李衛(wèi)萍;任云青;;RNA干擾技術(shù)沉默宮頸癌Hela細胞Survivin基因?qū)毎飳W(xué)特點的影響[J];現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學(xué);2014年12期

8 魏任雄;李克強;毛聯(lián)鋼;李旭軍;馮偉云;;靶向干擾CDK2AP1對乳腺癌MCF-7細胞體外遷移和侵襲的影響[J];浙江醫(yī)學(xué);2014年12期

9 張巖;田素禮;;RNA干擾技術(shù)在肝細胞癌治療方面的研究現(xiàn)狀及進展[J];中國現(xiàn)代普通外科進展;2014年05期

10 鄭露;周劍;;RNA干擾技術(shù)在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用[J];中國藥業(yè);2014年08期

相關(guān)會議論文 前1條

1 趙煒;陸娣;趙樹進;;RNAi研究進展[A];2014年廣東省藥師周大會論文集[C];2014年

相關(guān)博士學(xué)位論文 前6條

1 陸寓非;RNA干擾survivin和survivin小分子抑制劑YM155對食管鱗癌KYSE150細胞體內(nèi)外放射敏感性的實驗研究[D];山東大學(xué);2014年

2 葉瑞強;擬南芥AGO4/siRNA復(fù)合體細胞質(zhì)內(nèi)組裝和不依賴DCL的小RNA介導(dǎo)DNA甲基化的機理研究[D];浙江大學(xué);2014年

3 梁之聘;多靶位RNA干擾對HIV-1抑制作用的研究[D];南開大學(xué);2014年

4 崔蕾;病毒衣殼相關(guān)蛋白抑制宿主細胞凋亡與RNA沉默的分子機制研究[D];武漢大學(xué);2014年

5 王曉航;RNA干擾技術(shù)沉默血管內(nèi)皮生長因子-C（VEGF-C）基因?qū)κ彻馨┑姆乐巫饔肹D];山東大學(xué);2012年

6 張宏偉;Ap-1基因siRNA干擾對血管平滑肌細胞增殖、遷移、分化及細胞外基質(zhì)的影響[D];中國醫(yī)科大學(xué);2008年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前10條

1 馮雪;VEGF基因的RNA干擾及其在肝癌MHCC97L細胞表達的實驗研究[D];北京中醫(yī)藥大學(xué);2014年

2 張曉崢;RNA干擾技術(shù)研究五氯酚PCP對MCF-7細胞類固醇激素相關(guān)基因表達的影響[D];西南大學(xué);2014年

3 韓月光;擬南芥花發(fā)育相關(guān)基因AGO10的圖位克隆及功能研究[D];河北農(nóng)業(yè)大學(xué);2013年

4 郭s

本文編號：2513827