【摘要】：加工番茄作為重要的經(jīng)濟(jì)作物之一,具有重要的開發(fā)利用價(jià)值,病毒病害是影響加工番茄產(chǎn)量和品質(zhì)的主要病原之一,導(dǎo)致加工番茄減產(chǎn)甚至絕產(chǎn)。新疆加工番茄上主要的病毒包括:To MV、CMV、PVY以及STV,其中CMV和PVY對(duì)番茄植株產(chǎn)生嚴(yán)重的危害。RNA沉默是植物自主抵御病毒侵染的主要防御手段,其在植物抗病毒具有重要作用,RNA沉默復(fù)合體(RNA induced silencing complex;RISC)是RNA沉默中的主要元件,可以介導(dǎo)靶基因m RNA的特異性切割,從而達(dá)到RNA沉默效果,Argonaute(AGO)蛋白是組成RNA沉默復(fù)合體的核心蛋白,是RNA沉默所必需的。AGO蛋白首次在植物中被發(fā)現(xiàn),是一類高度保守的堿性蛋白,其蛋白家族成員均具有四個(gè)結(jié)構(gòu)域,分別為:N端結(jié)構(gòu)域,PIWI結(jié)構(gòu)域,PAZ結(jié)構(gòu)域以及MID結(jié)構(gòu)域。其中PAZ結(jié)構(gòu)域主要識(shí)別si RNA 3′端突出的2個(gè)堿基,負(fù)責(zé)與RNA結(jié)合;PIWI結(jié)構(gòu)域在結(jié)構(gòu)和功能上與RNase H相似,RISC具有核酸內(nèi)切酶的活性,切割靶基因。AGO蛋白家族成員被分為兩個(gè)亞組,分別為AGO亞組和PIWI亞組,不同物種中AGO蛋白家族成員的數(shù)目各不相同,其主要功能也存在較大差異。目前,番茄中已知的AGO蛋白家族成員有八個(gè),其中SlAGO1A和SlAGO1B可能影響植株高度和開花時(shí)間,SlAGO7被發(fā)現(xiàn)可能與葉和花器官的形成有關(guān),SlAGO4A被發(fā)現(xiàn)與植物抗逆有關(guān)。目的:本研究以加工番茄AGO4A為研究對(duì)象,通過酵母雙雜交驗(yàn)證其與PVY HC-Pro以及CMV 2b的相互作用;亞細(xì)胞定位、過量表達(dá)和干擾轉(zhuǎn)基因植株的獲得;為進(jìn)一步研究其功能提供初步依據(jù)。方法:將SlAGO4A基因與已知功能的AGO蛋白家族成員進(jìn)行蛋白結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列比對(duì)構(gòu)建進(jìn)化樹,并通過SMART進(jìn)行蛋白結(jié)構(gòu)域分析。通過Gen Bank中查找SlAGO4A序列以及本實(shí)驗(yàn)室的PVY HC-Pro以及CMV2b序列,利用GAL4酵母雙雜交系統(tǒng)中誘餌載體和目的載體序列設(shè)計(jì)引物,構(gòu)建誘餌載體和目的載體,通過酵母雙雜交系統(tǒng)說明書所提供的實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)。根據(jù)SlAGO4A基因序列和亞細(xì)胞定位載體序列設(shè)計(jì)合成引物,構(gòu)建GFP融合載體,并利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法進(jìn)行煙草遺傳轉(zhuǎn)化。通過激光共聚焦顯微鏡觀察GFP熒光。通過SlAGO4A基因序列和PIWI蛋白結(jié)構(gòu)域基因序列構(gòu)建過量表達(dá)載體和干擾載體,利用農(nóng)桿菌侵染法進(jìn)行番茄遺傳轉(zhuǎn)化,利用q RT-PCR技術(shù)對(duì)過量表達(dá)轉(zhuǎn)基因番茄植株進(jìn)行目的基因的相對(duì)表達(dá)量分析。結(jié)果:系統(tǒng)發(fā)育分析顯示,SlAGO4A與擬南芥At AGO4氨基酸相似性較高,歸于At AGO4亞組。SlAGO4A具有AGO蛋白家族成員所共有N端結(jié)構(gòu)域、PAZ結(jié)構(gòu)域、MID結(jié)構(gòu)域和PIWI結(jié)構(gòu)域,此外也具有DUF1785和Argo L2結(jié)構(gòu)域。成功構(gòu)建誘餌表達(dá)載體BD-CMV 2b、BD-PVY HC-Pro以及目的表達(dá)載體AD-SlAGO4A通過GAL4酵母雙雜交系統(tǒng)初步判斷SlAGO4A與PVY HC-Pro和CMV 2b并無相互作用。成功構(gòu)建GFP融合表達(dá)載體35S:GFP-SlAGO4A,遺傳轉(zhuǎn)化煙草植株,共獲得5個(gè)轉(zhuǎn)基因煙草株系,激光共聚焦顯微鏡觀察結(jié)果表明,SlAGO4A定位于細(xì)胞核和保衛(wèi)細(xì)胞膜上。成功構(gòu)建過量表達(dá)載體35S:SlAGO4A以及干擾載體35S:Ri PIWI,遺傳轉(zhuǎn)化番茄植株,并獲得6株過量表達(dá)轉(zhuǎn)基因番茄植株和5株干擾轉(zhuǎn)基因番茄株系,獲得的所有轉(zhuǎn)基因番茄植株中SlAGO4A基因的表達(dá)量均有明顯升高,相比正常植株來說增長(zhǎng)量大約在6-76×之間波動(dòng),證明成功獲得過表達(dá)植株。結(jié)論:通過系統(tǒng)發(fā)育結(jié)果我們推測(cè)SlAGO4A基因可能與At AGO4功能相似,根據(jù)酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)我們初步判斷SlAGO4A與PVY HC-Pro以及CMV2b無相互作用。成功獲得5個(gè)GFP融合轉(zhuǎn)基因株系,并通過熒光觀察確定SlAGO4A定位于細(xì)胞核和保衛(wèi)細(xì)胞膜上,成功獲得6個(gè)過量表達(dá)及5個(gè)干擾轉(zhuǎn)基因番茄株系。為研究其功能奠定基礎(chǔ),有助于深入研究番茄中該基因提供了理論基礎(chǔ)。
文內(nèi)圖片：
圖片說明： 600=0.01；取 2μL 點(diǎn)樣于 SD/-Trp-Leu、SD/-Trp-Leu-His-Ade 平板上，d，觀察結(jié)果。表 2.2 誘餌蛋白和對(duì)照檢測(cè)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化組配Table 2 Verification of Bait plasmid suitability for CytoTrap interaction a 結(jié)果與分析.1 PVY HC-Pro、CMV2b 和 SlAGO4A 基因的擴(kuò)增 質(zhì)粒組合 質(zhì)粒用量 感受BD + AD 100 ng 100μBD + AD-SlAGO4A 100 ng 100μBD-CMV 2b + AD 100 ng 100μBD-CMV 2b + AD-SlAGO4A 100 ng 100μBD PVY-HC-Pro + AD 100 ng 100μBD PVY-HC-Pro + AD-SlAGO4A 100 ng 100μ
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圖片說明： 600=0.01；取 2μL 點(diǎn)樣于 SD/-Trp-Leu、SD/-Trp-Leu-His-Ade 平板上，，d，觀察結(jié)果。表 2.2 誘餌蛋白和對(duì)照檢測(cè)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化組配Table 2 Verification of Bait plasmid suitability for CytoTrap interaction a 結(jié)果與分析.1 PVY HC-Pro、CMV2b 和 SlAGO4A 基因的擴(kuò)增 質(zhì)粒組合 質(zhì)粒用量 感受BD + AD 100 ng 100μBD + AD-SlAGO4A 100 ng 100μBD-CMV 2b + AD 100 ng 100μBD-CMV 2b + AD-SlAGO4A 100 ng 100μBD PVY-HC-Pro + AD 100 ng 100μBD PVY-HC-Pro + AD-SlAGO4A 100 ng 100μ
【學(xué)位授予單位】：石河子大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：S641.2

【參考文獻(xiàn)】

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4 郭s

本文編號(hào)：2513827