發(fā)布時(shí)間：2019-07-03 13:27

【摘要】：【目的】對(duì)黑曲霉(Aspergillus niger)阿魏酸酯酶基因進(jìn)行克隆和密碼子優(yōu)化,使其在畢赤酵母(Pichia pastoris X-33)中高效表達(dá)�！痉椒ā恳院谇够蚪M為模板,經(jīng)重疊延伸PCR擴(kuò)增得到阿魏酸酯酶基因(Anfae A),并對(duì)Anfae A基因進(jìn)行畢赤酵母密碼子偏好性"隨機(jī)優(yōu)化"和"一對(duì)一優(yōu)化",全基因合成后分別與表達(dá)載體pPICZαA連接,構(gòu)建表達(dá)載體pPICZαA-Anfae A、pPICZαA-op Anfae A I和pPICZαA-op Anfae A II。經(jīng)Sac I線(xiàn)性化后電轉(zhuǎn)化至P.pastoris X-33中,篩選陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子。搖瓶發(fā)酵4.5 d后,測(cè)定并比較重組阿魏酸酯酶(re Anfae A)酶活。【結(jié)果】密碼子優(yōu)化前阿魏酸酯酶酶活為6.8±0.1 U/m L,基因"一對(duì)一優(yōu)化"和"隨機(jī)優(yōu)化"后的重組酶酶活分別為5.2±0.1 U/m L和39.9±0.1 U/m L,"隨機(jī)優(yōu)化"后酶活比優(yōu)化前提高了近6倍,而"一對(duì)一優(yōu)化"后酶活僅為優(yōu)化前酶活的76.5%。重組阿魏酸酯酶的最適p H為5.5,且在pH 4.5-7.0穩(wěn)定性較好;最適反應(yīng)溫度50°C,在45-50°C較穩(wěn)定�！窘Y(jié)論】阿魏酸酯酶基因經(jīng)密碼子"隨機(jī)優(yōu)化"后進(jìn)行重組表達(dá),酶活顯著提高,對(duì)研究阿魏酸酯酶在畢赤酵母及其它宿主中的高效表達(dá)具有一定的借鑒意義,也為大規(guī)模工業(yè)化應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。
[Abstract]:[objective] to clone and optimize the ferulic acid esterase gene of Aspergillus Niger (Aspergillus niger) in Pichia pastoris (Pichia pastoris X 鈮，

本文編號(hào)：2509427