【摘要】：在亞洲國(guó)家中酸性土壤中,豆類作物的栽培非常普遍,豆類作物是這些國(guó)家人口糧食的主要蛋白源,而在酸性土壤中,過量的質(zhì)子和過量的鋁造成的根際鋁毒是豆類作物低產(chǎn)的主要原因,也是酸性土壤最常見的問題。為了探究豆類作物中的耐鋁基因的功能,通過轉(zhuǎn)基因技術(shù),提高豆類作物的耐鋁特性,本研究開發(fā)了一個(gè)高效的發(fā)根轉(zhuǎn)化系統(tǒng),這個(gè)方法可用于表征基因功能,調(diào)節(jié)脈沖作物的耐鋁性。1.建立高效的土壤農(nóng)桿菌介導(dǎo)煙草葉片產(chǎn)生根狀毛系統(tǒng)。利用發(fā)根土壤農(nóng)桿菌侵染煙草葉片,將土壤農(nóng)桿菌中的重要遺傳信息轉(zhuǎn)導(dǎo)到煙草的根狀毛中,其高效轉(zhuǎn)導(dǎo)的成功率是整個(gè)研究的關(guān)鍵。通過插入攜帶待研究的目的基因克隆到T-DNA上,通過電穿孔技術(shù)將攜帶目的基因的T-DNA插入土壤農(nóng)桿菌中,隨后通過介導(dǎo)轉(zhuǎn)化,土壤農(nóng)桿菌中的Ri質(zhì)粒會(huì)與攜帶目的基因的T-DNA共同進(jìn)入煙草葉片產(chǎn)生的根狀毛中。本研究的結(jié)果表明,利用土壤農(nóng)桿菌攜帶三種不同的目的基因介導(dǎo)野生型煙草和NtSTOP1突變體煙草葉片得到根毛的概率在80%以上,目的基因插入根毛的概率在90%以上。2.得到高效的根毛轉(zhuǎn)化系統(tǒng)后,為了進(jìn)一步驗(yàn)證使用土壤農(nóng)桿菌介導(dǎo)煙草根狀毛與煙草植株的根系是否在生理功能上一致,通過使用兩種不同形狀的煙草作為介導(dǎo)轉(zhuǎn)化的宿主進(jìn)行實(shí)驗(yàn),測(cè)定通過土壤農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化后的煙草的根毛的耐鋁基因的遺傳信息和有機(jī)酸分泌的情況,研究結(jié)果表明,通過土壤農(nóng)桿菌介導(dǎo)野生型煙草和NtSTOP1突變體煙草葉片形成的根狀毛的有機(jī)酸分泌水平和NtSTOP1,NtMATE,NtALS3的表達(dá)量信息與前人使用這兩種性狀的煙草植株實(shí)驗(yàn)得到的結(jié)果一致,即NtSTOP1突變體煙草根毛沒有分泌有機(jī)酸的功能,在無論是否有鋁脅迫的情況下,NtSTOP1和關(guān)聯(lián)基因NtMATE和NtALS3的表達(dá)量水平都很低。3.高效穩(wěn)定的煙草根狀毛系統(tǒng)的應(yīng)用。在木豆(Cajanuscajan(L.)中克隆得到MATE(多藥有毒化合物排出)基因并用綠色熒光蛋白進(jìn)行細(xì)胞融合,標(biāo)記CcMATEl::sGFP,在載體pBEAB中表達(dá)后通過電穿孔技術(shù)將其插入土壤農(nóng)桿菌中的迷你Ti質(zhì)粒中,隨后通過土壤農(nóng)桿菌介導(dǎo)NtSTOP1突變體煙草葉片得到根狀毛,通過進(jìn)行觀察綠色熒光蛋白的煙草根狀毛來篩選轉(zhuǎn)導(dǎo)成功的煙草根狀毛來進(jìn)行后續(xù)的研究。通過綠色熒光顯微鏡觀察得到CcMATE1在根尖細(xì)胞膜的細(xì)胞質(zhì)膜上表達(dá)。原本沒有耐鋁功能的NtSTOP1突變體煙草根狀毛,通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化后攜帶CcMATE1基因的NtST(OP1突變體煙草根狀毛根尖有機(jī)酸分泌量是對(duì)照實(shí)驗(yàn)有機(jī)酸分泌量的4倍。綜上所述,通過土壤農(nóng)桿菌介導(dǎo)產(chǎn)生根狀毛的根尖生理特性與植株本身根尖的生理特性一致,通過這個(gè)方法可以高效的檢測(cè)到轉(zhuǎn)基因作物中的特定目的基因的細(xì)胞定位表達(dá)和生理指標(biāo)。通過這個(gè)方法利用土壤農(nóng)桿菌攜帶目的基因轉(zhuǎn)導(dǎo)到根狀毛中也可以快速的測(cè)定目的基因的功能和生理特性,相對(duì)于常規(guī)的轉(zhuǎn)基因方法,利用土壤農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)導(dǎo)模式作物產(chǎn)生根狀毛系統(tǒng)來檢測(cè)目的基因的功能省去了插入標(biāo)記篩選基因這個(gè)步驟,更加快捷方便的測(cè)定了目的基因的功能。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：廣西大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：Q943.2

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本文編號(hào)：2497922