【摘要】：【目的】制備抗CAS9蛋白質(zhì)的單克隆抗體,建立轉(zhuǎn)基因水稻中CAS9蛋白質(zhì)的免疫印跡檢測方法,了解CAS9蛋白質(zhì)在轉(zhuǎn)基因水稻中的表達(dá)特征�！痉椒ā恳詭as9的質(zhì)粒DNA為模板,PCR擴(kuò)增Cas9 5′端810 bp片段后克隆到p ET30a載體中,將酶切驗證且序列正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入表達(dá)菌Condon Plus中,經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)CAS9蛋白質(zhì)(N端270氨基酸),用純化的重組蛋白質(zhì)作為免疫原免疫小鼠,制備單克隆抗體,用免疫印跡分析篩選特異性和靈敏度高的抗體細(xì)胞株。用特異性引物PCR擴(kuò)增轉(zhuǎn)基因水稻的Cas9,用免疫印跡檢測轉(zhuǎn)基因水稻中的CAS9蛋白質(zhì)。將重組CAS9蛋白質(zhì)和帶有CAS9的水稻苗期葉片蛋白質(zhì)進(jìn)行平行免疫印跡分析,用Image J軟件采集信號繪制CAS9蛋白質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)曲線,進(jìn)而對水稻葉片中的CAS9蛋白質(zhì)進(jìn)行定量分析。提取單粒稻米的總蛋白質(zhì),稀釋后用免疫印跡分析CAS9蛋白質(zhì)的檢測下限,提取多個時期、部位的水稻材料的總蛋白質(zhì),包括苗期的地上部和地下部,分蘗期的莖、莖節(jié)、葉鞘、葉片等,用SDS-PAGE分離后免疫印跡檢測比較CAS9蛋白質(zhì)的表達(dá)特征。【結(jié)果】通過體外克隆、誘導(dǎo)表達(dá)獲得了純化的重組CAS9蛋白質(zhì)N端片段,免疫小鼠后得到42株陽性雜交瘤細(xì)胞株,經(jīng)篩選鑒定到#12D2細(xì)胞株對水稻樣品的檢測具有較好的特異性和靈敏度。用該抗體通過免疫印跡檢測了轉(zhuǎn)基因水稻,所建立的免疫印跡方法對重組CAS9蛋白質(zhì)的檢測下限約為0.25 ng。在水稻苗期葉片中,CAS9蛋白質(zhì)約占鮮重的0.00005%,可檢出單粒稻米8%樣品(約2 mg)中的CAS9蛋白質(zhì)。在苗期地上部CAS9蛋白質(zhì)的表達(dá)豐度高于地下部,分蘗期莖和葉片中表達(dá)量較高,根和葉鞘表達(dá)量較低。【結(jié)論】獲得特異性強(qiáng)、靈敏度高的抗CAS9單克隆抗體,建立了檢測轉(zhuǎn)基因水稻中CAS9蛋白質(zhì)的免疫印記方法,揭示了CAS9蛋白質(zhì)在水稻不同部位的表達(dá)特征,并展示了在其他植物中的應(yīng)用潛力。
[Abstract]:[objective] to prepare monoclonal antibody against CAS9 protein and establish an immunoblotting method for detection of CAS9 protein in transgenic rice to understand the expression characteristics of CAS9 protein in transgenic rice. [methods] using plasmid DNA with Cas9 as template, the fragment of Cas9 5 'end 810 bp was amplified by PCR and cloned into p ET30a vector, and the recombinant plasmid confirmed by restriction enzyme digestion and with correct sequence was transferred into the expression strain Condon Plus. The expression of CAS9 protein (N-terminal 270amino acid) was induced by IPTG. The purified recombinant protein was used as immunogen to immunize mice, and monoclonal antibodies were prepared. The specific and sensitive antibody cell lines were screened by immunoblotting. The Cas9, of transgenic rice was amplified by specific primers PCR and the CAS9 protein in transgenic rice was detected by immunoblotting. The recombinant CAS9 protein and the protein of rice seedling leaves with CAS9 were analyzed by parallel immunoblotting. The standard curve of CAS9 protein was drawn by Image J software, and then the CAS9 protein in rice leaves was quantitatively analyzed. The total protein of single grain rice was extracted, the detection limit of CAS9 protein was analyzed by immunoblotting after dilution, and the total protein of rice material at several stages was extracted, including shoot and underground part of seedling stage, stem, stem node, leaf sheath and leaf at tiller stage. The expression characteristics of CAS9 protein were detected and compared by immunoblotting after SDS-PAGE separation. [results] the expression characteristics of CAS9 protein were compared by cloning in vitro. The purified N-terminal fragment of recombinant CAS9 protein was induced and 42 positive hybridoma cell lines were obtained after immunization with mice. The # 12D2 cell line was identified as having good specificity and sensitivity for the detection of rice samples. Transgenic rice was detected by immunoblotting with this antibody. The detection limit of recombinant CAS9 protein by the established immunoblotting method was about 0.25 ng.. In the leaves of rice seedling stage, CAS9 protein accounted for about 0.00005% of the fresh weight, and the CAS9 protein in 8% of the single grain rice sample (about 2 mg) could be detected. The expression abundance of CAS9 protein in shoot was higher than that in underground part at seedling stage, and the expression level in stem and leaf at tiller stage was higher than that in root and leaf sheath. [conclusion] the monoclonal antibody against CAS9 with strong specificity and high sensitivity was obtained. The immunoblotting method for detection of CAS9 protein in transgenic rice revealed the expression characteristics of CAS9 protein in different parts of rice and showed its application potential in other plants.
【作者單位】： 河北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院;北京華大蛋白質(zhì)研發(fā)中心有限公司;
【基金】：高等學(xué)校博士學(xué)科點專項科研基金(20131302110006)
【分類號】：S511

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本文編號：2497326