【摘要】：丹參(Salvia miltiorrhiza Bunge.)根莖是我國傳統(tǒng)中藥材,具有較高藥用價(jià)值。目前丹參藥材主要以人工種植滿足市場需求,但時(shí)常遭受季節(jié)性干旱造成死苗或影響產(chǎn)量。研究已發(fā)現(xiàn),丹參葉綠體對中度以上干旱非常敏感,常造成光合作用功能下降,但其機(jī)理不清楚。光系統(tǒng)Ⅱ具有吸取光能、引發(fā)電荷分離、傳遞電子并且催化水分解功能。D2蛋白是組成光系統(tǒng)Ⅱ復(fù)合體的核心之一,研究其編碼的psbD基因,對揭示丹參光合作用機(jī)理具有重要意義。本研究選取陜西天士力公司提供的優(yōu)良丹參SH-B,對psbD基因上游1355 bp片段進(jìn)行克隆,并以全長啟動子為模板設(shè)計(jì)出5’端缺失啟動子片段,再分別與報(bào)告基因GUS相融合,構(gòu)建多個(gè)表達(dá)載體,使用GV3101農(nóng)桿菌浸染本氏煙草葉片,分析各啟動子片段瞬時(shí)表達(dá)差異,從而驗(yàn)證psbD基因啟動子功能,旨在為后續(xù)研究丹參響應(yīng)干旱脅迫的光合作用機(jī)理及與育性之間的關(guān)系奠定基礎(chǔ)。取得的主要結(jié)果如下:(1)以丹參葉綠體DNA為模板克隆了丹參psbD基因上游啟動子區(qū)(1355 bp)。在PLACE網(wǎng)站上分析全長啟動子,發(fā)現(xiàn)含有多個(gè)與外部環(huán)境有關(guān)的順式作用元件,如CAAT-box、ATCA-motif、MBS等。(2)用Primer 5.0設(shè)計(jì)特異引物,以全長啟動子為模板,克隆出1147 bp,891 bp,746bp,582 bp,451 bp,323 bp,230 bp,142 bp 8個(gè)5’端缺失片段。將全長啟動子以及8個(gè)5’端啟動子缺失序列與去除CaMV 35S啟動子的pCAMBIA1304連接,成功構(gòu)建出表達(dá)載體,按序列長度分別定名為:SalP-1355、SalP-1147、SalP-891、SalP-746、SalP-582、SalP-451、SalP-323、SalP-230、SalP-142。(3)將已構(gòu)建好的表達(dá)載體轉(zhuǎn)導(dǎo)GV3101農(nóng)桿菌,瞬時(shí)轉(zhuǎn)染本氏煙草葉片,對葉片進(jìn)行GUS染色分析,結(jié)果顯示,全長啟動子以及各5’端缺失啟動子均可驅(qū)動GUS基因表達(dá),且各啟動子活性有明顯差異。(4)用含有各表達(dá)載體的農(nóng)桿菌GV3101轉(zhuǎn)染煙草葉片,提取總RNA,反轉(zhuǎn)錄成cDNA后進(jìn)行RT-PCR定量分析,結(jié)果表明SalP-1355和SalP-451表達(dá)水平最高,SalP-582最低。結(jié)合生物信息學(xué)分析推測,在1355 bp-891 bp、746 bp-582 bp、451 bp-230 bp區(qū)間內(nèi)可能有增強(qiáng)子存在,在891 bp-746 bp、582 bp-451 bp、230 bp-142 bp區(qū)間可能有沉默子存在。
[Abstract]:Salvia miltiorrhiza (Salvia miltiorrhiza Bunge.) Rhizome is a traditional Chinese medicinal material in China, which has high medicinal value. At present, Salvia miltiorrhiza is mainly planted to meet the market demand, but often suffered from seasonal drought caused by dead seedlings or affecting the output of Salvia miltiorrhiza. It has been found that the chloroplast of Salvia miltiorrhiza is very sensitive to moderate drought and often causes the decline of photosynthesis, but its mechanism is not clear. Photosystem 鈪，

本文編號：2472066